前列腺素E1对大鼠脊髓损伤后PARP-1表达
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【摘要】 目的:观察前列腺素E1对大鼠脊髓损伤后多聚ADP核糖聚合酶(PPRP-1) 表达的影响。方法 成年SD大鼠30只，采用Allen重物打击法制作大鼠脊髓损伤模型，随机分为前列腺素E1治疗组及对照组各15只。治疗组每日尾静脉注射前列腺素E15ug/d，对照组尾静脉注射等量生理盐水。取损伤段脊髓组织，免疫组化检测6小时及12小时后PPRP-1的表达变化。结果 6小时及12小时后，前列腺素E1治疗组PARP-1表达均低于对照组(P<0.05)。结论 前列腺素E1可减少大鼠继发性脊髓损伤时的氧化应激反应，可能作为脊髓损伤的一种有潜力的新药。
【关键词】 前列腺素E1；脊髓损伤；多聚ADP核糖聚合酶
【中图分类号】R352【文献标识码】A【文章编号】1005-0515(2011)03-0010-01
继发性脊髓损伤与脊髓序列性组织自毁性破坏发生的继发性性损伤相关，其中，氧化应激反应在损伤的继发性病理变化中有着重要作用[1]。多聚ADP核糖聚合酶(poly(ADP-ribose)polymerase PARP)是一种DNA修复酶，DNA受到氧化损伤时被活化，参与脊髓继发性损伤[2]。手术、药物及基因治疗的运用对脊髓损伤带来一定的效果，但脊髓损伤所致的致残率仍相当高。前列腺素E1 (prostaglandin E1, PGE1) 是一种具有高度生物活性物质,它可舒张血管平滑肌，降低外周阻力,扩张微血管，改善全身血流动力学，并可抑制血小板聚集。本实验通过观察PARP-1的表达，探讨PGE1对脊髓继发性损害的保护作用。
1 材料与方法
1.1 材料:成年健康雄性SD大鼠30只，3~4月龄，体重(250±30) g，由湖北省实验动物中心提供。实验器材为Allen打击器，FA2004A电子天平，OLYMPUS显微镜，荧光显微镜。具体试剂及来源如下：PGE1注射液(北京泰德公司)，多聚ADP核糖聚合酶(PARP-1)兔抗大鼠多克隆抗体(eBioscience公司)，FITC标记的山羊抗兔抗体IgG(北京中杉金桥生物技术公司)。
1.2 方法:
1.2.1 脊髓损伤大鼠模型制备大鼠称重，按30 mg•kg-1腹腔注射3 %戊巴比妥纳麻醉。俯卧位固定于手术台上，以脊柱为中心纵行切开背部皮肤和皮下组织，剥离两侧椎旁肌肉，自动拉钩牵开暴露T6~8棘突和椎板，切除T7棘突和椎板，除去硬膜外脂肪，暴露硬膜囊，预打击脊髓上放置0.4cm×0.5 cm垫片。采用改良Allen S打击法(10 g×5 cmf)损伤脊髓，以双下肢猛烈抽搐，造成截瘫为有效打击，关闭伤口。术后室温控制在20℃~28℃，所有动物每天肌肉注射青霉素钠10万U，并用碘伏消毒伤口，每8小时挤压膀胱排尿，定时喂食。
1.2.2 大鼠分组及给药:大鼠按照计算机随机分组，分为PGE1治疗组及对照组各15只。治疗组每日尾静脉注射前列腺素E15ug/d，对照组尾静脉注射等量生理盐水。
1.2.3 荧光免疫组化检测:分别在术后6及12小时时间点将动物麻醉后，开胸先以生理盐水行心脏灌注至液体变清后，以4 %的多聚甲醛磷酸盐缓冲液(PBS)灌注30分钟，然后切取伤段脊髓。将组织用10 %的福尔马林固定2小时，然后依
次经7.5 %、15 %、30 %的蔗糖溶液脱水，每次2小时。-20℃冰冻切片。将切片在冷纯丙酮中固定10分钟后，进行荧光免疫组化操作。对同一批次实验,设定相同的采集图像参数，使用相同图像分辨率，用Image J软件分析荧光强度。
1.3 统计分析:数据以均数±标准差表示，用SPSS13.0软件进行统计学分析，组间比较采用t检验(以p<0.05有统计学意义)。
2 结果
2.1 免疫组化：PARP-1检测结果(图1及表1)：对照组和治疗组PARP-1表达量随时间延长呈上升趋势，两个时间点治疗组阳性细胞数较同时间点的对照组明显减少；荧光强度分析显示：在12小时后，治疗组PARP-1荧光强度与对照组差异有显著性(P<0.05)。
2.2 光镜观察结果治疗组脊髓轻度水肿，散在小出血点，神经元神经纤维轻度变性。对照组脊髓水肿严重，神经元变性、坏死，灰质内可见灶性出血。部分尼氏小体溶解，神经纤维紊乱。
3 讨论
脊髓损伤的发病机制中，氧化应激反应学说在其中占有重要地位。国内外研究证实：与氧化应激相关的PARP-1因子在脊髓损伤的机制中有一定的作用，而针对PARP-1的抑制的高表达是治疗脊髓损伤的重要环节。本研究结果表明前列腺素E1可通过抑制PARP-1的表达，减少大鼠继发性脊髓损伤时的氧化应激反应，可能作为脊髓损伤的一种有潜力的新药。
在脊髓损伤后，局部脊髓组织产生的活性氧簇包括超氧阴离子、过氧化氢、超氧化物、过氧亚硝基等，它们造成DNA损伤，促使PARP-1因子被活化。进一步的研究发现，大量活化的PARP也可以在凋亡诱导因子AIF介导下引起细胞凋亡。PARP-1参与DNA的复制和转录，在维持基因组稳定和细胞死亡过程中发昏重要作用。国外研究证实：在临床上使用PARP抑制剂可以引导肿胀向凋亡的转变，具体机制与细胞内ATP及NAD+水平上升相关。本实验研究也表明，治疗组和对照组PARP-1表达的差异影响着细胞凋亡，反映PARP的活化是影响脊髓损伤后细胞凋亡的重要因素之一。
前列腺素E1 (prostaglandin E1, PGE1) 是一种具有高度生物活性物质,它可舒张血管平滑肌，降低外周阻力,扩张微血管 ......
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