类肝素酶在非酒精性脂肪肝模型大鼠肝脏组织中的表达及意义
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【摘要】目的: 研究类肝素酶在非酒精脂肪肝大鼠模型肝脏组织中的表达，以探讨类肝素酶在非酒精性脂肪肝发生中的作用，为脂肪肝的临床监测与治疗提供新思路。方法: 建立正常大鼠模型(30只)，非酒精性脂肪肝模型大鼠(30只)，采用免疫组化SABC法测定两组模型肝脏组织中类肝素酶的表达。实验数据的统计方法：计量资料采用单因素方差分析和t检验；计数资料采用χ2检验。结果: 在非酒精性脂肪肝大鼠模型肝脏组织中类肝素酶的阳性率高于正常模型肝脏组织，差异有统计学意义(P<0.01)。结论: 非酒精性脂肪肝模型大鼠肝脏组织中类肝素酶的表达增加，提示类肝素酶与非酒精性脂肪肝的发生有关。
【关键词】类肝素酶；非酒精性脂肪肝
【中图分类号】R335【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2011)04-0181-01
非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一种无过量饮酒史、以肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征。随着人们生活方式及饮食习惯的改变，其发病率正在逐年升高，在世界范围内成为慢性肝病的最常见病因之一。NAFLD 的发病机制还不十分清楚, 目前被广泛接受的理论是Day 和James在1998 年提出的二次打击学说。NAFLD各种病因引发脂质代谢异常，FFA和甘油三酯在肝内沉积，通过线粒体和过氧化物酶体β氧化及微粒体ω氧化等途径触发氧应激反应，脂质过氧化反应通过上述机制损伤线粒体，激发机体释放炎症介质和细胞因子，导致肝细胞发生变性、凋亡、坏死和纤维化的发生。因此，炎症介质和细胞因子的产生在非酒精性肝病的发生、发展中居于重要地位。研究表明, 在NAFLD 的发生和发展过程中有大量细胞因子产生并参与了疾病的演变过程,目前的研究认为类肝素酶在NAFLD的发病过程中，由脂代谢异常引起机体释放大量的活性氧和氧自由基，脂质过氧化的终产物和蛋白质结合成复合物，激活机体产生免疫反应而参与肝损害，诱导细胞死亡、炎症和纤维化[9]。免疫系统的大量细胞和体液成分都贮存在血管内，在免疫反应的过程中，它们要通过血管内皮进入炎性反应部位的细胞外基质、(extracellular matrix，ECM)。目前研究更倾向于强调ECM成分的改变对免疫反应的影响。本实验着重了解肝素酶是否参与非酒精性脂肪肝的发生发展。
1 材料与方法
1.1 标本来源:实验动物：清洁级雄性Wistar大鼠60只，体重180-220g，由山西医科大学实验动物中心提供。
1.2 实验方法:
1.2.1 实验分组造模：Wistar雄性大鼠60只，随机分为两组，正常组30只,模型组30只。对照组：饲以普通饲料和自来水；模型组：采用高脂饮食致大鼠非酒精性脂肪性肝：高脂饮食配方：普通饲料84%、猪油14%、胆固醇2%；分别在第8、10周末每组各取6只隔夜禁食处死大鼠采集标本，留取肝组织待检,12周取18只隔夜禁食处死大鼠采集标本，留取肝组织待检(预试验表明类肝素酶和TGF-β1在8,10周肝组织中表达不明显)。
1.2.2 肝脏组织HE染色及脂肪肝判断标准：取部分肝右叶放于10%中性福尔马林液中固定，石蜡包埋，5μm切片，并HE染色后在显微镜下观察。
1.3 标本处理:所有标本连续切片5张，厚为4μm，置于经多聚赖氨酸(Poly-L-Lysin)处理过的玻片上，58℃烤片2h后4℃保存。再各取石蜡标本10μm 3张，置于1.0ml无菌Eppendorf管中，4℃保存备用。
1.4 类肝素酶的免疫组化检测:采用免疫组织化学方法,将组织切片与兔抗鼠类肝素酶抗体共孵化,4 ℃过夜,生物素标记的羊抗兔免疫球蛋白G( IgG) 处理后,滴加SABC ,DAB 显色,苏木素轻度复染,脱水、透明、封片。类肝素酶表达免疫组化阳性信号为棕黄色,结果判断标准:在放大400 倍下,每张切片随机选取10 个视野,通过灰度计算阳性面积以及阳性面积占总面积的百分比(即阳性率)。
1.5 结果判断:细胞浆内含有棕黄色颗粒者为类肝素酶和TGF-β1阳性表达。在放大400 倍下,每张切片随机选取10 个视野,通过灰度计算阳性面积以及阳性面积占总面积的百分比(即阳性率)。6 统计方法
采用SPSS13.0系统软件包，计量资料结果以X±S表示，采用t检验和单因素方差分析；计数资料采用χ2检验。以P<0.05为显著性差异指标。对所采集数据用Excell2003软件手工辅助进行制图。
2 结果
两组模型的阳性表达
2.1 非酒精性脂肪肝模型大鼠(12周)的类肝素酶的阳性表达高于正常模型大鼠的类肝素酶的阳性表达，两组比较有统计学意义( P = 0.0052, P < 0.01)。
2.2 类肝素酶在非酒精性脂肪肝模型大鼠肝脏组织中的表达:类肝素酶阳性染色主要定位于细胞浆，呈棕黄色颗粒，灶状、巢状或散状分布。
3 讨论
3.1 非酒精性脂肪性肝病(NAFLD):非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指临床病理上从仅出现单纯性脂肪肝、到发生非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)、和进一步演变为肝纤维化、肝硬化的一种疾病。范建高等用普通饲料加2%胆固醇、10%猪油给大鼠食用24周后，其体重、肝指数显著高于正常对照组，8周进展为单纯性脂肪肝，12-24周表现为脂肪性肝炎，即在单纯性脂肪肝的基础上出现小叶内和汇管区的炎症，程度进行性加重，24周所有造模大鼠均出现窦周纤维化。本课题主要对非酒精性单纯性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎两个阶段进行研究。
3.2 类肝素酶与非酒精性脂肪肝的关系:类肝素酶在非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)的发生发展中的作用：目前的研究认为在NASH的发病过程中，有脂代谢异常引起机体释放大量的活性氧和氧自由基，脂质过氧化的终产物和蛋白质结合成复合物，激活机体产生免疫反应而参与肝损害，诱导细胞死亡，炎症和纤维化[9]。免疫系统的大量细胞和体液成分都贮存在血管内，在免疫反应的过程中，它们要通过血管内皮进入炎性反应部位ECM。目前研究更倾向于强调ECM成分的改变对免疫反应的影响。类肝素酶通过降解ECM中的成份，尤其是Ⅳ型胶原为炎症介质的迁移开拓道路，同时类肝素酶在水解胶原的同时释放一部分炎症介质，如：MMPs等，加剧炎症反应的发生。目前的研究认为在NASH的发病过程中，有脂代谢异常引起机体释放大量的活性氧和氧自由基，脂质过氧化的终产物和蛋白质结合成复合物，激活机体产生免疫反应而参与肝损害，诱导细胞死亡、炎症和纤维化[9]。免疫系统的大量细胞和体液成分都贮存在血管内，在免疫反应的过程中，它们要通过血管内皮进入炎性反应部位的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)。目前研究更倾向于强调ECM成分的改变对免疫反应的影响。类肝素酶通过降解ECM中的成份，尤其是Ⅳ型胶原为炎症介质的迁移开拓道路 ......
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