伤寒杆菌检测实验方法的研讨
【中图分类号】R352【文献标识码】A【文章编号】1005-0515(2011)04-0243-01
伤寒是由伤寒杆菌经消化道侵入而引起的急性传染病，遍布于世界各地，以热带、亚热带地区为多见，在我国和其他发展中国家仍是一种常见的传染病.。伤寒杆菌经口腔到消化道侵害小肠粘膜而入血，可造成伤寒杆菌菌血症。伤寒病常称“伤寒热”， 其症状包括高烧，可达39°至40°C，其他症状有腹痛、严重腹泻、头痛、身体出现玫瑰色斑等。其中肠道出血或穿孔是其最严重的并发症，其传染途径为粪口途径，传染力很高。所以，伤寒的早期诊断十分重要。现对我中心使用的伤寒杆菌检测实验方法研讨如下。
1 材料和方法
1.1 材料：选取送检伤寒患者137例，其中男性77例，女性60例。年龄8—63岁，平均38岁。
1.2 检测方法：
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1.2.1 血清学检测：肥达试验是临床上常用于辅助诊断伤寒的传统方法。其原理是用伤寒杆菌的菌体(O)抗原和鞭毛(H)抗原以及副伤寒甲、乙、丙菌液与稀释的待测血清反应，根据凝集效价判断血清中有无伤寒杆菌的抗体。早期肥达试验需要急性期和大约间隔10天的康复期血清，两份标本之间抗O抗体或抗H抗体滴度升高4倍，更有诊断意义。伤寒杆菌的 O抗原与A群、B群沙门氏菌有部分相同抗原，与甲、乙两种副伤寒杆菌有一定的交叉反应，因此，肥达反应诊断伤寒杆菌常出现假阳性，特异性差，敏感性低，而且抗原抗体结合出现凝集沉淀常需要20 h以上。
1.2.2 免疫学检测：①酶联免疫吸咐试验(ELISA)：根据抗原或抗体特异性免疫反应原理设计，将已知的抗原或抗体结合在某种固相载体上，以辣根过氧化酶为指示剂，标记在另一种抗原或抗体上，加入酶作用底物，酶与底物发生反应后，底物显色，根据底物显色的深浅定性或定量地检测样本中的抗体或抗原。②浸染试验(Dipstick assay)：又称快速试纸法，是近些年发展起来的一种用胶体金作指示剂的快速诊断方法。基本原理是先将特异性的抗原或单克隆抗体固定于试纸条(硝酸纤维薄膜)的一端，检测时将试纸条的另一端浸入待测样品，由于毛细管作用，样品液向前移动，如待测样品中含有相应的抗体或抗原，则当样品液移至固定有抗原或抗体区时会发生特异性结合，在显色系统的作用下，该区域出现一定的颜色。此法具有操作简单，不需任何仪器，20 min即能报告结果，适合现场查病时使用。浸染试验在特异性、敏感性、简单、快速方面优于常规方法。
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1.2.3 聚合酶链反应(PCR)：PCR是一种体外DNA扩增技术，其基本原理是酶促DNA合成反应，即在模板DNA、引物和脱氧核糖核酸存在及DNA聚合酶的作用下，使DNA链扩增。它由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成，是现阶段检测伤寒杆菌的最快速准确的方法。①套式聚合酶链反应：又称二次PCR，在这种技术中，首先用一对外引物进行第一轮PCR，然后再使用第一对引物扩增的DNA序列内部的一对引物再次扩增。②一次PCR：只设计一对引物用于PCR即完成检测，但一次PCR检测临床血标本容易受到血中大量存在的外周单个核细胞DNA非特异性扩增的影响而使敏感性降低。③多重PCR：多重PCR是在同一个反应管中同时完成多个不同基因扩增的PCR。(4)免疫磁珠分离PCR：免疫磁珠就是将直径0.05 μl～4 μl具有超顺磁性的微粒表面经化学修饰，使之与特异性抗体牢固结合，成为能与特异性抗原结合且有磁性的磁珠。
2 结果
经过我中心对伤寒杆菌检测，132例患者得到了准确的诊断，并且进行了对症治疗；5例患者检测结果不准确，仍需临床进一步观察再送检确诊。
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3 讨论
伤寒患者的诊断主要依据病原学的实验室诊断，由于抗生素的广泛应用，导致血培养时伤寒杆菌的检出率明显降低，常规血清学检测患者血清中的特异性抗体，其特异性和敏感性均存在一定的问题，从而影响检测结果的准确性和可靠性。肥达氏试验早期阳性率低，需到第3周、第4周才可达70%，实际上只有回顾性诊断价值，且假阳性较高。免疫学检测的方法具有灵敏度高、特异性好，反应时间短，操作简便，结果易于判断等特点，较肥达氏试验特异、敏感和快速，且价格低廉，一般实验室都能开展，易于普及推广，适用于伤寒的早期诊断，具有较高的临床价值。PCR技术检测伤寒杆菌的方法敏感度更高，但是这类方法操作麻烦、对环境要求较高，且价格昂贵，很难普及。
检测伤寒杆菌的方法很多，各有其优缺点，伤寒杆菌的检测方法将向早期、快速、准确、灵敏、特异等方向发展，特别是免疫学检测方法、PCR等现代分子生物学技术的联用，会使伤寒杆菌的检测方法日趋成熟，为临床诊断提供更加快速准确的科学诊断依据。
参考文献
[1] 杨绍基用聚合酶链反应快速检测血液中的伤寒杆菌中山医科大学学报 1995;16(4):68-71
[2] 朱忠勇;实用医学检验学;北京人民军医出版社 1992：881
作者单位：150056 哈尔滨市疾控中心检验科, 百拇医药(万宇)
伤寒是由伤寒杆菌经消化道侵入而引起的急性传染病，遍布于世界各地，以热带、亚热带地区为多见，在我国和其他发展中国家仍是一种常见的传染病.。伤寒杆菌经口腔到消化道侵害小肠粘膜而入血，可造成伤寒杆菌菌血症。伤寒病常称“伤寒热”， 其症状包括高烧，可达39°至40°C，其他症状有腹痛、严重腹泻、头痛、身体出现玫瑰色斑等。其中肠道出血或穿孔是其最严重的并发症，其传染途径为粪口途径，传染力很高。所以，伤寒的早期诊断十分重要。现对我中心使用的伤寒杆菌检测实验方法研讨如下。
1 材料和方法
1.1 材料：选取送检伤寒患者137例，其中男性77例，女性60例。年龄8—63岁，平均38岁。
1.2 检测方法：
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1.2.1 血清学检测：肥达试验是临床上常用于辅助诊断伤寒的传统方法。其原理是用伤寒杆菌的菌体(O)抗原和鞭毛(H)抗原以及副伤寒甲、乙、丙菌液与稀释的待测血清反应，根据凝集效价判断血清中有无伤寒杆菌的抗体。早期肥达试验需要急性期和大约间隔10天的康复期血清，两份标本之间抗O抗体或抗H抗体滴度升高4倍，更有诊断意义。伤寒杆菌的 O抗原与A群、B群沙门氏菌有部分相同抗原，与甲、乙两种副伤寒杆菌有一定的交叉反应，因此，肥达反应诊断伤寒杆菌常出现假阳性，特异性差，敏感性低，而且抗原抗体结合出现凝集沉淀常需要20 h以上。
1.2.2 免疫学检测：①酶联免疫吸咐试验(ELISA)：根据抗原或抗体特异性免疫反应原理设计，将已知的抗原或抗体结合在某种固相载体上，以辣根过氧化酶为指示剂，标记在另一种抗原或抗体上，加入酶作用底物，酶与底物发生反应后，底物显色，根据底物显色的深浅定性或定量地检测样本中的抗体或抗原。②浸染试验(Dipstick assay)：又称快速试纸法，是近些年发展起来的一种用胶体金作指示剂的快速诊断方法。基本原理是先将特异性的抗原或单克隆抗体固定于试纸条(硝酸纤维薄膜)的一端，检测时将试纸条的另一端浸入待测样品，由于毛细管作用，样品液向前移动，如待测样品中含有相应的抗体或抗原，则当样品液移至固定有抗原或抗体区时会发生特异性结合，在显色系统的作用下，该区域出现一定的颜色。此法具有操作简单，不需任何仪器，20 min即能报告结果，适合现场查病时使用。浸染试验在特异性、敏感性、简单、快速方面优于常规方法。
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1.2.3 聚合酶链反应(PCR)：PCR是一种体外DNA扩增技术，其基本原理是酶促DNA合成反应，即在模板DNA、引物和脱氧核糖核酸存在及DNA聚合酶的作用下，使DNA链扩增。它由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成，是现阶段检测伤寒杆菌的最快速准确的方法。①套式聚合酶链反应：又称二次PCR，在这种技术中，首先用一对外引物进行第一轮PCR，然后再使用第一对引物扩增的DNA序列内部的一对引物再次扩增。②一次PCR：只设计一对引物用于PCR即完成检测，但一次PCR检测临床血标本容易受到血中大量存在的外周单个核细胞DNA非特异性扩增的影响而使敏感性降低。③多重PCR：多重PCR是在同一个反应管中同时完成多个不同基因扩增的PCR。(4)免疫磁珠分离PCR：免疫磁珠就是将直径0.05 μl～4 μl具有超顺磁性的微粒表面经化学修饰，使之与特异性抗体牢固结合，成为能与特异性抗原结合且有磁性的磁珠。
2 结果
经过我中心对伤寒杆菌检测，132例患者得到了准确的诊断，并且进行了对症治疗；5例患者检测结果不准确，仍需临床进一步观察再送检确诊。
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3 讨论
伤寒患者的诊断主要依据病原学的实验室诊断，由于抗生素的广泛应用，导致血培养时伤寒杆菌的检出率明显降低，常规血清学检测患者血清中的特异性抗体，其特异性和敏感性均存在一定的问题，从而影响检测结果的准确性和可靠性。肥达氏试验早期阳性率低，需到第3周、第4周才可达70%，实际上只有回顾性诊断价值，且假阳性较高。免疫学检测的方法具有灵敏度高、特异性好，反应时间短，操作简便，结果易于判断等特点，较肥达氏试验特异、敏感和快速，且价格低廉，一般实验室都能开展，易于普及推广，适用于伤寒的早期诊断，具有较高的临床价值。PCR技术检测伤寒杆菌的方法敏感度更高，但是这类方法操作麻烦、对环境要求较高，且价格昂贵，很难普及。
检测伤寒杆菌的方法很多，各有其优缺点，伤寒杆菌的检测方法将向早期、快速、准确、灵敏、特异等方向发展，特别是免疫学检测方法、PCR等现代分子生物学技术的联用，会使伤寒杆菌的检测方法日趋成熟，为临床诊断提供更加快速准确的科学诊断依据。
参考文献
[1] 杨绍基用聚合酶链反应快速检测血液中的伤寒杆菌中山医科大学学报 1995;16(4):68-71
[2] 朱忠勇;实用医学检验学;北京人民军医出版社 1992：881
作者单位：150056 哈尔滨市疾控中心检验科, 百拇医药(万宇)