香丹关节腔注射治疗膝骨性关节炎关节软骨I\II型损伤的实验研究
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【摘要】 目的：通过香丹注射液关节腔注射，治疗膝骨性关节炎关节软骨I、 II型损伤的实验研究，了解香丹注射液对关节软骨I、 II型损伤的治疗，探讨其作用机制。方法：通过手术采用Hulth 法建立模型，分设香丹组和对照组，分别予以香丹注射液、生理盐水注射。从对关节软骨形态进行大体观察，对比，观察关节软骨损伤及修复。测量膝关节外周径，观察关节肿胀程度。根据改良Mankin法，对比观察药物对关节软骨的修复作用。检测关节液内NO含量并进行对比，观察用药后关节内炎性物质的变化等方面进行研究。结果：8周时，香丹组关节肿胀程度明显减轻，关节软骨色泽及完整性香丹组尚无明显优势。10周时香丹组和对照组已有明显差别。14周时香丹组优于对照组。结论：香丹注射液能明显减少关节积液，消除关节滑膜炎症，缓解疼痛。尤其对膝骨关节炎早期，能对软骨修复再生起一定作用，延缓，疾病的发展进程。
【关键词】膝骨性关节炎;关节软骨; II型损伤;实验动物;香丹注射液
【中图分类号】R579【文献标识码】A【文章编号】1005-0515(2011)04-0060-02
香丹注射液是心脑血管系统用药，具有良好的改善循环血量的作用，已是临床常用药物，但至今还没有人将它用于关节腔注射以治疗膝骨性关节炎的报导。本研究从动物实验角度出发，从大体上观察关节软骨的形态、色泽，关节肿胀的测量、病理组织学观察，关节液中NO含量等方面，初探中药香丹注射液对关节软骨I、 II型损伤的影响及作用机理，为扩大香丹注射液适应症的范围及给药途径提供理论基础。弥补了口服给药的不足，延缓了关节的退变,促进骨性关节炎病人早期康复，恢复正常的工作与生活，提高生活质量，具有较大的社会效益和经济效益。
1 材料与方法
1.1 实验动物：健康家兔，雌性40只，2.0～2.5kg ，平均2.3kg,6～8月龄，造模前统一饲养1周。
黑龙江中医药大学动物实验中心提供。
1.2实验药物香丹注射液每支10ml , 生产厂家：正大青春宝药业有限公司。注射用水每支10ml，购自黑龙江中医药大学附属第二医院药局。
1.3 实验方法:采用Hulth 法建立模型。以 1.25%硫喷妥钠2ml/kg耳缘静脉给药，同时予5mg 安定注射液加倍稀释后肌注。随机选取左或右膝施行手术，作髌内侧纵斜行切口约1cm , 切断内侧副韧带，切除内侧半月板，切断前后交叉韧带，术中按无菌技术操作并注意保护关节软骨面不受损伤。术后不固定伤肢，术后给予肌注庆大霉素8万单位抗炎治疗三天，分笼饲养。每天驱赶动物2次，每次30分钟，共4周。
1.4 分组及给药方法:将模型兔随机分二组，在造模后4周开始给药。用药组膝关节腔每5日注射香丹注射液，连续给药16次，对照组关节腔内注射生理盐水。关节腔内注射剂量计算(现无国家规定的不同动物间关节腔内注射剂量换算计算公式，结合目前的动物实验给药方法、剂量和换算方法，采用自定关节腔内注射剂量计算公式)：动物与人等效剂量的换算公式，即：实验动物每只给药剂量(ml)＝人的关节腔给药剂量(ml)×家兔等效剂量的体型系数/人等效剂量的体型系数×(人的平均体重/平均实验动物体重)2/3≈0.3521ml，计算损耗后基本定为0.40ml。
2 观察指标及方法
每组分别于术后4W，8 W，10 W和14 W以空气栓塞法各处死5只家兔，进行检查。关节软骨形态色泽，损伤与修复：术后4W，处死动物后见关节液清亮，关节囊无挛缩、粘连和新生物形成，滑膜无充血水肿，软骨有损伤，失完整性。术后8 W，修复组织呈黄白色外观，表面粗糙；呈连绵的小丘状，与周围关节软骨分界清楚。术后10W，修复组织亦较以前为多，淡黄白色，表面变的光滑，有一定弹性，与周围正常软骨分界仍能辨认。
术后14W，修复组织色泽、质地同正常关节软骨，表面光滑，与周围软骨组织界面平齐并完全整合，结合紧密，不易剥离，与周围正常软骨组织界限模糊。
膝关节外周径测量：二组动物分别于造模前在关节处用染色笔标出部位，分别于注射药物后第4W ，8W，10W测量周径，差值做比较，将各组计量资料用均数±标准差表示，差异的显著性用随机区组设计的方差分析，各组之间的比较用SNK-Q检验进行统计学分析。
组织学观察：
术后8W，对照组见缺损区凹陷，有血凝块，被覆纤维组织，甲苯胺兰染色呈无异染性着色的纤维组织；香丹组见少量增殖的类似幼稚软骨细胞的细胞和较少的基质，细胞形态较小，甲苯胺兰染色异染性不明显，未见明显的多核炎性细胞。
术后10W，对照组缺损区有纤维组织覆盖,有原纤维形成，呈波纹状走行，修复组织异染，少而不均匀；香丹组可见到较多的类幼稚软骨细胞和基质，细胞分布不均，呈明显的甲苯胺兰异染性着色。
术后14W，对照组修复组织多为较厚的原纤维，呈波纹状排列，甲苯胺兰染色少而不均匀；香丹组修复的类软骨组织和周围的正常软骨基本连成一片，但排列非柱状，较正常软骨细胞不规则，未见炎性细胞浸润，甲苯胺兰着色较前均匀。
关节液中NO含量：
兔关节液和血清中NO、NOS测定结果比较，NO、iNOS在骨关节液、血清中均有明显表达，对照组兔关节液、血清中NO、iNOS的水平显著高于正常组(P<0.05)。香丹组NO、iNOS水平低于对照组，两组比较差异有统计学意义(P﹤0.05)。
3 讨论
3.1 香丹注射液的组成及有效成份:香丹注射液是由中药丹参和降香经现代制剂技术制成的中药注射液，具有活血化瘀、消肿止痛作用，其有效成份有丹参酮，丹参素、原儿茶醛，没药烯等，能扩张冠状动脉、改善重要器官的微循环，抑制炎性介质释放，有抗炎作用，能增加网状内皮系统功能，调节免疫状态，保护细胞，促进细胞再生。其中丹参功同四物具有祛瘀生新等功效，降香有散瘀止血等功效。临床已被广泛应用于临床心脑血管等多种疾病的治疗。
3.2 香丹注射液治疗膝骨性关节炎关节软骨I、 II型损伤的作用机制:香丹注射液关节腔内注射治疗膝关节软骨损伤，既保留了中药治标治本的优势，又发挥现代给药方式的优势，根据局部给药的学术思想，按照膝关节腔的结构特点，当药物直接注入关节腔内后，药物在直接高浓度接触病变部位的同时，药液可经退变的软骨裂隙进入软骨下骨，改善其骨内血运，修复软骨及软骨下囊变区、改善骨内压，又能直接经滑膜吸收，改善滑膜血运，消除滑膜炎症及淤血肿胀，阻断退行性膝关节病的疾病发展过程。另外，通过关节软骨基质的物理负压作用及化学性阴阳离子的作用，使药物直接进入软骨，对软骨修复再生起一定作用。有利于发挥药物的治疗作用。
一氧化氮(NO)是OA发病过程中的重要炎症介质，是一种新发现的生物信息递质，在软骨损伤中起重要作用。NO是结构简单的无机小分子，半衰期很短，越来越多的证据表明，NO与OA的发病机制密切相关，抑制NO的产生，可以延缓OA的进程。在体内，NO是由一氧化氮合成酶(NOS)作用于L-精氨酸产生的。NOS有结构型(cNOS)和诱导型(iNOS)之分，其中在关节软骨中起作用的是iNOS。骨关节炎关节液中NO的产生主要来源于关节软骨细胞和滑膜细胞 ......
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