P16基因甲基化状态与子宫肌瘤发生机制的研究(1)
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【摘要】目的：通过检测子宫肌瘤组织与相邻的正常子宫肌层组织的P16基因启动区甲基化的状态的差异性，以探讨子宫肌瘤的发病机理；方法：对2009年9月至2010年12月在我院就医的60例30-48岁妇女子宫肌瘤患者，采用甲基化特异性聚合酶链式反应(Methylation-Specific PCR, MSP)法检测P16基因启动区域CpG岛异常甲基化，可在一定程度上反应该基因失活情况，从肿瘤的分子生物角度研究妇女子宫肌瘤的特点及子宫肌瘤的发病机理；以及采用化学发光法检测雌孕激素受体，子宫肌瘤与雌孕激素受体水平的关系；以及采用统计方法分析数据，探讨P16基因启动区甲基化状态变化与雌孕激素受体水平的关系；结果：受体阳性细胞的百分数分为4级：阴性(一)，阳性细胞<25%或不染色；弱阳性(+)，阳性细胞25%一50%，阳性染色较清晰；阳性(++)阳性细胞5l%一75%，阳性染色较清晰；强阳性(+++)阳性细胞>76%，细胞核深棕色；结论：甲基容纳和免疫组化测定了30例子宫肌瘤及其临近肌层组织总体DNA甲基化状态，发现与临近肌层相比子宫肌瘤组织呈现总体低甲基化，子宫肌瘤对雌、孕激素具有高应答性, 且雌激素受体(estrogen receptor, ER)和孕激素受体(progesterone receptor, PR)高表达。
【关键词】P16基因；子宫肌瘤；发生机制
【中图分类号】R361 【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2011)08-0304-02
子宫肌瘤(hysteromyoma)是女性生殖器官最常见的良性肿瘤之一，多见于3O～5O岁妇女。子宫肌瘤为良性肿瘤，但它们可无限制生长，且可发生癌变。研究表明许多分裂素、原癌基因、肿瘤抑制物和其他分子与肌瘤发生相关，但没有一个因素或系统可以解释之。基础与临床均证实性激素在其中起着决定性的作用，但其确切机制未明。随着后基因时代的到来,已有更多的研究者从基因的表达方面来比较子宫肌瘤和正常子宫肌层的异同,从而找出有明显差异的基因变化,为进一步深入研究提供基础。本文就是试图探索P16基因甲基化状态与子宫肌瘤发生机制的深层次关系，从而更好地治疗子宫肌瘤提供最佳的方案。
1 资料与方法
1.1 一般资料:2009年9月至2010年12月在我院就医的60例30-48岁妇女子宫肌瘤病例。研究组：30例子宫肌瘤组织，对照组：30例相应正常子宫肌层组织。
1.2 治疗方法:
1.2.1 p16基因启动区甲基化状态检测——采用MSP法:样本立即沉浸在液态氮和储存在70°C超低温冰箱中,直至另行加工。样品中组织进行苏木精染色，确定样本的准确性。根据上述二组病例用MSP法检测P16基因启动子区域CpG岛的甲基化情况。选择上述标本用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行聚合酶链反应(PCR)扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳分析，确定与引物互补的DNA序列的甲基化状态。
1.2.2 采用免疫组化法：雌孕激素受体检测法:测定30例患者子宫肌瘤瘤体和非瘤肌层组织的雌孕激素受体含量。留取30例患者子宫肌瘤患者手术切除肌瘤标本，同时取非瘤子宫肌层组织(3cm)作为对照，采用免疫组织化学sP法进行检测。标本用10%甲醛溶液浸泡24小时，常规脱水，石蜡组织切片3-4trm，脱蜡，3%过氧化氢室温孵育10分钟，蒸馏水冲洗，PBS液浸泡，滴加ER、PR单克隆抗体，4℃冰箱过夜。PBS液冲洗后滴加鼠二抗IsG.HRP，DAB显色，水洗，苏木精复染。
收取手术切除的新鲜肌瘤组织及正常组织(约3cm)，0.9%氯化钠液清洗，置液氮中冻存，取标本100mg，剪碎，经预冷的PBS缓冲液洗涤2次，加入lml总蛋白质提取液，匀浆，振摇水浴30分钟，应用低温高速离心机保持4℃，1500r/min，离心20分钟，将上清液吸至干净的EP管一30℃保存，取50ul上清液按BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白含量。样品煮沸3分钟，取50ug总蛋白的样晶液进行SDS-PAGE电泳，电泳完成，进行电转膜，转膜结束后，进行膜封闭和一抗、二抗孵育，PVDF膜通过KC显色，最后曝光于X胶片上，常规显影、定影，经扫描后图像分析转件处理，得出相对光密度值。
1.3 结果:判断光镜下观察结果，细胞核内有棕黄色颗粒者为阳性细胞，根据受体阳性细胞的百分数分为4级：阴性(一)，阳性细胞<25%或不染色；弱阳性(+)，阳性细胞25%一50%，阳性染色较清晰；阳性(++)阳性细胞5l%一75%，阳性染色较清晰；强阳性(+++)阳性细胞>76%，细胞核深棕色。
1.4 统计学方法:统计学处理所得数据计数资料采用x2检验，经SPSS11.0统计软件进行处理，进行统计分析。
2 讨论
P16基因甲基化是肿瘤细胞科研中最常采用的标志之一，本研究探讨P16基因甲基化子宫肌瘤发病的相关性以及孕激素、雌激素受体与子宫肌瘤发病的相关性，统计分析P16基因甲基化异常和孕激素、雌激素受体变化在子宫肌瘤发病的相关性，从分子水平研究发病机制。寻找特异性好、敏感度高、检测方便的分子指标，目前国内相关报导尚少，此为本课题的创新之处。
子宫肌瘤为良性肿瘤，但它可无限制增长，且可发生癌变，研究认为子宫肉瘤中存在P16基因的异常表达，而子宫肌瘤可癌变为肉瘤，其间是否有联系，与P16基因的表达有关，是本课题研究的目的。国外研究发现，P16蛋白在平滑肌肿瘤中的表达率明显高于其在正常肌层中的表达率，Keith M.和Amy P.N.在基因水平研究中发现P16基因在子宫平滑肌瘤中表达比正常平滑肌组织高2一5倍，表明子宫平滑肌瘤普遍受到这种肿瘤抑制基因产物缺失的影响。
甲基化可降低启动子的活性，异常甲基化导致相应肿瘤抑制基因失活，从而导致肿瘤的发生。近年来发现肿瘤细胞的总体甲基化水平比正常细胞低，但是伴有某些CpG位点甲基化程度增高。Li等通过DNA甲基容纳和免疫组化测定了23例子宫肌瘤及其临近肌层组织总体DNA甲基化状态，发现与临近肌层相比子宫肌瘤组织呈现总体低甲基化。
另外，大量实验研究表明, 子宫肌瘤为激素依赖性肿瘤, 外源性雌激素能促进子宫肌瘤的生成和生长，并提出了雌激素假说，后来一系列实验表明孕激素在子宫肌瘤的发生中起着重要作用,较正常子宫肌层相比, 子宫肌瘤对雌、孕激素具有高应答性, 且雌激素受体(estrogen receptor, ER)和孕激素受体(progesterone receptor, PR)高表达;最近研究表明, PR 配基(孕激素及其拮抗剂)能够转显性抑制ER 信号通路和肌瘤细胞的生长, 表明ER 和PR 信号通路之间存在相互作用, 激素配基效应的调节可能是通过干扰ER、PR, 甚至包括雄激素受体信号通路而实现的 ......
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