下呼吸道感染大肠埃希菌的检测及耐药性分析
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大肠埃希菌是呼吸内科下呼吸道感染的常见菌，由于各种抗生素的广泛使用，甚至滥用，使大肠埃希菌对各种抗生素的敏感性不断下降，这些耐药的产生与大肠埃希菌产生的超广谱β-内酰胺酶(Exten-
ded-Spectrumβ-lactamase,ESBLs)、AmpC酶有关[1,2]。文献报道，大肠埃希菌对头孢他啶、头孢噻肟、哌拉西林等应用广泛的抗生素敏感性逐年下降。为此，我们对本院呼吸内科住院尘肺患者分离的256株大肠埃希菌进行耐药谱及ESBLs、AmpC酶检测，指导临床抗感染用药。
1 材料与方法
1.1实验菌株:
2006年7月-2010年7月呼吸内科住院下呼吸道感染患者临床送检的痰液标本。病人早晨漱口，深咳，取痰液送检，连续3日。用SENSITITRE荧光法全自动快速微生物鉴定仪(Aris)进行菌株鉴定。大肠埃希菌ATCC25922为标准菌株。
1.2 药敏试验:
将大肠埃希菌在LB液体培养基(OXOID)中于37℃培养过夜，用LB培养液调整浊度至0.5麦氏浓度。
采用Kirby-Bauer法。Mueller-Hinton琼脂(英国Oxoid公司)，受试抗菌药物共18种，分别是：哌拉西林(齐鲁制药公司)、哌拉西林/三唑巴坦(美国Wyeth-Ayerst公司)、头孢西丁(海南海药公司海口制药厂)、头孢他啶(Galaxo-Smithkline苏州公司)、头孢噻肟(华北制药凯瑞特公司)、头孢曲松(中诺药业公司)、头孢吡肟(中美上海施贵宝制药公司)、美罗培南(日本住友制药株式会社)、阿米卡星(上海旭东海普药业公司)、环丙沙星(广州南新制药有限公司)、左氧氟沙星(江苏豪森药业股份有限公司)。取0.1ml菌液点于平板中央，用涂布棒均匀涂布整个平板，制成含菌平板。将抗生素药敏纸片贴至含菌平板表面，35℃孵育24小时，测量抑菌圈直径。
1.3大肠埃希菌ESBLs检测:
按照1.2方法进行菌液涂布琼脂平板及贴药敏纸片，35℃孵育24小时，测量抑菌圈直径。药敏纸片为头孢他啶、头孢噻肟、头孢他啶+克拉维酸和头孢噻肟+克拉维酸。按照临床实验室标准化协会(CLSR)制定的标准鉴别敏感菌株和耐药菌株，用WHONET软件分析耐药率[3]。按照CLSR的标准，当头孢他啶或头孢噻肟+克拉维酸的抑菌圈直径减去头孢他啶或头孢噻肟的抑菌圈直径大于等于5mm时为产耐药酶ESBLs的菌株。
1.4 AmpC酶检测:
待检菌酶粗提物的制备 按NCCLS纸片扩散法的标准对所有菌株测定对头孢西丁的敏感性。对其不敏感的菌株(抑菌圈直径≤17 mm)进行酶的粗提。将受试菌菌落制成0.5麦氏单位菌液，取50 ul菌液加入12 ml胰酶消化大豆肉汤于35℃孵育4-6 h，于4℃4000 r/min离心20 min，弃上清液，将沉淀经-20℃与37℃水浴反复冻融6次后过滤，滤液经MH琼脂平板ATCC25922菌液接种于MH琼脂平板上常规细菌培养阴性后于-20℃保存待检测。
大肠埃希菌AmpC检测 三维试验参照参考文献[3]方法进行，在水解酪蛋白胨(MH)琼脂平板上均匀涂布0.5麦氏单位的大肠埃希菌(ATCC 25922)菌液，将FOX纸片贴于平板中央，用无菌刀片沿FOX纸片边缘5mm处放射状切一裂缝，裂缝里加入25ul酶粗提物，35℃孵箱培养16-18h后，观察抑菌圈的形状，如果平皿上出现一个沿槽周围生长指向FOX纸片的矢状菌苔，即为三维试验阳性。
1.5数据统计:
利用SPSS11.5软件对实验结果进行t检验及x2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1ESBLs和AmpC酶检出结果:
从256株大肠埃希菌中检出5株单产AmpC酶、58株单产ESBLs、3株同时产AmpC酶+ESBLs，检出率分别为1.9%、22.7%、1.2%。
2.2大肠埃希菌的耐药谱:
18种抗生素中美洛培南没有检测到耐药菌，其他17种抗生素均有不同数量耐药菌产生，大肠埃希菌对18种抗生素的耐药谱见表1。
2.3 大肠埃希菌ESBLs、AmpC表型阳性菌的耐药谱:
供试的18种抗生素对大肠埃希菌ESBLs、AmpC表型阳性菌的耐药率普遍高于阴性菌。哌拉西林全部耐药，头孢曲松、头孢噻肟、头孢他啶对ESBLs、AmpC阳性菌的耐药率很高，但是对ESBLs、AmpC阴性菌的耐药率显著降低，P<0.05。ESBLs、AmpC表型阳性的菌株耐药谱比表型阴性的菌株更广泛。ESBLs、AmpC表型阳性大肠埃希菌对18种抗生素的耐药谱见表2。
表1 256株大肠埃希菌对抗生素的耐药情况(%)
表2 ESBLs、AmpC表型阳性菌株对
18种抗生素的耐药率(%)
单产AmpC酶、ESBLs及同时产AmpC酶+ESBLs菌株对18种监测抗生素(美洛培南除外)的耐药率均高于平均水平。
3 讨论
革兰氏阴性杆菌对β-内酰胺抗生素耐药的主要机制为(1)产生各种β-内酰胺水解酶(2)β-内酰胺类抗生素作用靶位青霉素结合蛋白(PBPs)的改变，(3)细菌外膜通透性下降；(4)外排泵作用；(5)生物膜的形成[3,4]等 ......
大肠埃希菌是呼吸内科下呼吸道感染的常见菌，由于各种抗生素的广泛使用，甚至滥用，使大肠埃希菌对各种抗生素的敏感性不断下降，这些耐药的产生与大肠埃希菌产生的超广谱β-内酰胺酶(Exten-
ded-Spectrumβ-lactamase,ESBLs)、AmpC酶有关[1,2]。文献报道，大肠埃希菌对头孢他啶、头孢噻肟、哌拉西林等应用广泛的抗生素敏感性逐年下降。为此，我们对本院呼吸内科住院尘肺患者分离的256株大肠埃希菌进行耐药谱及ESBLs、AmpC酶检测，指导临床抗感染用药。
1 材料与方法
1.1实验菌株:
2006年7月-2010年7月呼吸内科住院下呼吸道感染患者临床送检的痰液标本。病人早晨漱口，深咳，取痰液送检，连续3日。用SENSITITRE荧光法全自动快速微生物鉴定仪(Aris)进行菌株鉴定。大肠埃希菌ATCC25922为标准菌株。
1.2 药敏试验:
将大肠埃希菌在LB液体培养基(OXOID)中于37℃培养过夜，用LB培养液调整浊度至0.5麦氏浓度。
采用Kirby-Bauer法。Mueller-Hinton琼脂(英国Oxoid公司)，受试抗菌药物共18种，分别是：哌拉西林(齐鲁制药公司)、哌拉西林/三唑巴坦(美国Wyeth-Ayerst公司)、头孢西丁(海南海药公司海口制药厂)、头孢他啶(Galaxo-Smithkline苏州公司)、头孢噻肟(华北制药凯瑞特公司)、头孢曲松(中诺药业公司)、头孢吡肟(中美上海施贵宝制药公司)、美罗培南(日本住友制药株式会社)、阿米卡星(上海旭东海普药业公司)、环丙沙星(广州南新制药有限公司)、左氧氟沙星(江苏豪森药业股份有限公司)。取0.1ml菌液点于平板中央，用涂布棒均匀涂布整个平板，制成含菌平板。将抗生素药敏纸片贴至含菌平板表面，35℃孵育24小时，测量抑菌圈直径。
1.3大肠埃希菌ESBLs检测:
按照1.2方法进行菌液涂布琼脂平板及贴药敏纸片，35℃孵育24小时，测量抑菌圈直径。药敏纸片为头孢他啶、头孢噻肟、头孢他啶+克拉维酸和头孢噻肟+克拉维酸。按照临床实验室标准化协会(CLSR)制定的标准鉴别敏感菌株和耐药菌株，用WHONET软件分析耐药率[3]。按照CLSR的标准，当头孢他啶或头孢噻肟+克拉维酸的抑菌圈直径减去头孢他啶或头孢噻肟的抑菌圈直径大于等于5mm时为产耐药酶ESBLs的菌株。
1.4 AmpC酶检测:
待检菌酶粗提物的制备 按NCCLS纸片扩散法的标准对所有菌株测定对头孢西丁的敏感性。对其不敏感的菌株(抑菌圈直径≤17 mm)进行酶的粗提。将受试菌菌落制成0.5麦氏单位菌液，取50 ul菌液加入12 ml胰酶消化大豆肉汤于35℃孵育4-6 h，于4℃4000 r/min离心20 min，弃上清液，将沉淀经-20℃与37℃水浴反复冻融6次后过滤，滤液经MH琼脂平板ATCC25922菌液接种于MH琼脂平板上常规细菌培养阴性后于-20℃保存待检测。
大肠埃希菌AmpC检测 三维试验参照参考文献[3]方法进行，在水解酪蛋白胨(MH)琼脂平板上均匀涂布0.5麦氏单位的大肠埃希菌(ATCC 25922)菌液，将FOX纸片贴于平板中央，用无菌刀片沿FOX纸片边缘5mm处放射状切一裂缝，裂缝里加入25ul酶粗提物，35℃孵箱培养16-18h后，观察抑菌圈的形状，如果平皿上出现一个沿槽周围生长指向FOX纸片的矢状菌苔，即为三维试验阳性。
1.5数据统计:
利用SPSS11.5软件对实验结果进行t检验及x2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1ESBLs和AmpC酶检出结果:
从256株大肠埃希菌中检出5株单产AmpC酶、58株单产ESBLs、3株同时产AmpC酶+ESBLs，检出率分别为1.9%、22.7%、1.2%。
2.2大肠埃希菌的耐药谱:
18种抗生素中美洛培南没有检测到耐药菌，其他17种抗生素均有不同数量耐药菌产生，大肠埃希菌对18种抗生素的耐药谱见表1。
2.3 大肠埃希菌ESBLs、AmpC表型阳性菌的耐药谱:
供试的18种抗生素对大肠埃希菌ESBLs、AmpC表型阳性菌的耐药率普遍高于阴性菌。哌拉西林全部耐药，头孢曲松、头孢噻肟、头孢他啶对ESBLs、AmpC阳性菌的耐药率很高，但是对ESBLs、AmpC阴性菌的耐药率显著降低，P<0.05。ESBLs、AmpC表型阳性的菌株耐药谱比表型阴性的菌株更广泛。ESBLs、AmpC表型阳性大肠埃希菌对18种抗生素的耐药谱见表2。
表1 256株大肠埃希菌对抗生素的耐药情况(%)
表2 ESBLs、AmpC表型阳性菌株对
18种抗生素的耐药率(%)
单产AmpC酶、ESBLs及同时产AmpC酶+ESBLs菌株对18种监测抗生素(美洛培南除外)的耐药率均高于平均水平。
3 讨论
革兰氏阴性杆菌对β-内酰胺抗生素耐药的主要机制为(1)产生各种β-内酰胺水解酶(2)β-内酰胺类抗生素作用靶位青霉素结合蛋白(PBPs)的改变，(3)细菌外膜通透性下降；(4)外排泵作用；(5)生物膜的形成[3,4]等 ......
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