腺苷药物预适应对缺血心肌的保护作用(2)
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参见附件。
1.2主要仪器：千分之一天平(METTLER公司)；动物用呼吸机(浙江大学动物仪器厂)；紫外可见分光光度计(上海医用设备厂)；显微镜(OLLIMPUS公司)。
1.3主要药品：腺苷注射液(沈阳光大药业公司)；TTC试剂(浙江省华东医药股份公司)；伊凡蓝试剂(瑞士Restang公司)；Mn-SOD、ICAM-1、iNOS检测试剂(南京建成生物有限公司)。
2试验分组
试验用Wistar大鼠140只，随机分为7组，每组20只：
A组对照组只开胸暴露心脏，不结扎冠状动脉，24小时后取血清和心肌标本供检测用。
B组心肌梗塞组结扎冠状动脉后1小时，关闭胸腔。24小时后取血清和心肌标本供检测用。
C组IP组结扎冠状动脉前降支5分钟，放松3分钟，做三个循环。24小时以后，结扎冠状动脉前降支1小时，取血清和心肌标本供检测用。
D组腺苷PP组
D1组PP1个循环组腺苷PP24小时，结扎冠状动脉1小时。取血清和心肌标本供检测用。
D2组PP2个循环组腺苷PP24小时，再注射相同剂量，做二个循环。24小时以后，结扎冠状动脉前降支1小时，取血清和心肌标本供检测用。
D3组PP3个循环组腺苷PP24小时，再注射相同剂量，做三个循环。24小时以后，结扎冠状动脉前降支1小时，取血清和心肌标本供检测用。
D4组PP4个循环组腺苷PP24小时，再注射相同剂量，做四个循环。24小时以后，结扎冠状动脉前降支1小时，取血清和心肌标本供检测用。
3动物模型的建立
3.1建立心肌梗塞动物模型。
3.2建立IP动物模型。
3.3建立腺苷PP模型
4标本的收集和处理
4.1Mn-SOD暴露下腔静脉，抽取静脉血3ml，4000转∕分钟离心5分钟，取血清置于-20℃低温冰箱保存。
4.2心肌标本试验终点时间，剪下心脏，剪下梗塞部位。
5试验检测
5.1心肌梗塞面积的检测：按TTC染色的方式进行。
5.2Mn-SOD、ICAM-1、iNOS的检测：严格按照说明书操作进行。
6统计分析
资料以均数±标准差表示，各试验组之间比较用T检验，组内之间比较用单因素方差分析。P<0.05为有统计学差异，P<0.01为有显著统计学差异。
7试验结果
7.1肉眼观察:结扎冠状动脉前降支1小时以后，肉眼可见心室前壁颜色逐渐呈现浅淡、苍白样改变，收缩幅度下降，部分伴有室壁瘤形成。
7.2心肌梗塞面积的测定结果
心肌梗塞面积在心肌梗塞组中最大，平均达到了22.86%，而在IP以后，心肌梗塞面积有明显的下降，两者之间有明显的统计学差异。在PP三个循环组，心肌梗塞面积达到最小，但是单纯的增加PP的刺激量，并不能相应的继续减少心肌梗塞的面积，在PP四个循环组，心肌梗塞面积较PP三个循环组稍有升高。PP三个循环组和四个循环组与心肌梗塞组相比较有明显的统计学差异(p<0.01)，但是PP三个循环和四个循环组之间没有统计学差异(p>0.05)。
7.3Mn-SOD的测定结果
心肌梗塞以后血清中的Mn-SOD含量表达较对照组有明显的升高，两者之间有统计学差异(p<0.05)。Mn-SOD的含量随PP循环次数的增加而有部分增加，其含量在PP三个循环的时间达到最高峰，而在四个循环以后逐渐下降，其同心肌梗塞组之间有明显的统计学差异(p<0.01)。
7.4ICAM-1的测定结果
心肌梗塞以后血清中的ICAM-1含量表达较对照组有明显的升高，两者之间有统计学差异(p<0.05)。ICAM-1的含量随PP循环次数的增加而增加，其含量在PP四个循环的时间达到最高峰，其同心肌梗塞组之间有明显的统计学差异(p<0.01)。
7.5iNOS的测定结果
心肌梗塞以后血清中的iNOS含量表达较对照组有明显的升高，两者之间有统计学差异(p<0.05)。IP后血清中iNOS含量表达较心肌梗塞组有所下降，两者之间有统计学差异(p<0.05)。iNOS的含量随PP循环次数的增加而减少，其含量在PP四个循环达最低值。(p>0.05)
8讨论
PP对心肌有明显的保护作用，腺苷是机体能量代谢的产物，主要来源于ATP降解。心脏短暂缺血后大量ATP降解，导致局部心肌组织腺苷积聚[2-3]。SOD是体内自由基重要的清除酶之一，有三种不同的类型，分别命名为：Mn-SOD、Cu/Zn-SOD和Fe-SOD。Mn-SOD在IP中发挥了重要的作用，而在IP第一相中产生的Mn-SOD还可能在第二相保护作用中发挥了更大的保护作用[4-6]。Yamashita的研究则指出Mn-SOD蛋白表达的高峰和IP发挥作用的时间相同，并且Mn-SOD的含量和心肌梗塞面积呈负相关。国外学者Yamashita曾经指出Mn-SOD可能是缺血IP的最终效应器[6]。NOS分为两大类，即原生型NOS(constitutiveNOS，cNOS)和诱生型NOS(inducibleNOS，iNOS)。缺血后几分钟内iNOS活性即增加，继之NO浓度升高，随时间的延长iNOS蛋白表达下降；NOS已被选择性地确定为预适应延迟相的调节物。在野生型小鼠，初发预适应后24hiNOS的表达和活性增强。无iNOS等位基因的纯和型小鼠缺乏延迟相预适应的保护作用[7-10]。ICAM-1又称CD54，是分子量为76～114KD的单链糖蛋白，微血管内皮是其主要的靶细胞。许多研究证实，发生脑缺血、脑和脊髓缺血再灌注损伤，ICAM-1表达增加，使得白细胞与血管内皮细胞间粘附力增加,进而贴壁、滚动、嵌塞微血管,造成局部血液动力学环境改变。白细胞跨过内皮细胞间隙进入周围组织，释放大量炎性介质和细胞因子，造成缺血区域的脑组织损伤，并吸引更多的白细胞进入组织，形成恶性循环[11-13] ......
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