心理应激对模拟高原低压低氧环境下大鼠海马单胺递质的影响(2)
1.3 模拟高原低压低氧的方法 每次2～3只大鼠放入小动物低压舱内，自由饮食水，匀速 减压至模拟海拔6000m高度(PB 47.3kPa)，维持24h。低氧处置前，各组大鼠均在相同的小动 物低压舱环境内适应性饲养一周(每天放置1h)。
1.4 推挽灌流法收集海马细胞外液 各实验组处理后的大鼠，立即在戊巴比妥钠(40mg/kg ，ip)麻醉后，固定于立体定位仪上(江湾I型脑立体定位仪，上海)，按Paxinos[6]等大鼠 立体定位图谱，确定右侧腹侧海马坐标，牙科钻开颅，插入自制推挽灌流套管(其外管和内 管的外径分别为1.0mm和0.6mm)至海马腹侧(Bregma后5.2mm、向右旁开5.0mm、深7.0mm)。 灌流液为人工脑脊液(aCSF)(145mM NaCl，2.7mM KCl，1mM MgCl2，2mM Na2HPO4和1.2mM Ca Cl2(pH 7.2~7.4)，由恒速微量注射泵(AJ5805，上海)持续灌流，灌流速度为10.0uL/min。 持续收集40min，收集管周围用碎冰降温，收集过程在避光条件下进行，前20min灌注液弃用 ，后20min时灌注液作为检测液，灌流液用0.22um微孔膜过滤后，立即放入-70℃冰箱保存 待测。
, 百拇医药
1.5 高效液相色谱-电化学测定
1.5.1 仪器 美国Waters高效液相色谱仪；M460电化学检测器；M745B数据处机；510泵；U 6K进样器。
1.5.2 试剂 标准品为去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)、5-羟吲哚乙酸( 5- HIAA)、高香草酸(HVA)、3-氧基4羟基苯乙酸(DOPAC)均由美国Sigma公司提供；3，4-二羟 苄胺(DHBA)作为内标也由Sigma公司提供。0.1mol/LHCL将上述标准品配制成100μg/L贮液 ，置于-70℃保存。标准工作液：取适量贮液，以0.1mol/LHCl稀释至所需要浓度(现用现配) 。庚烷磺酸钠离子对试剂为Sigma产品，甲醇为优级纯，其它试剂均为分析纯，实验用水为 超纯水。
1.5.3 检测 每次直接进样50μl，进行检测，具体方法见程连弟等[4]的报道。 具体的仪器及检测方法见马文涛[2]及程连弟[7]等的报道。
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1.6 血浆皮质酮水平的测定 推挽灌流结束后，心脏插管取血，置于20U/ml肝素抗凝的试 管混匀，于4℃、3000r/min条件下离心分离血浆，于-20℃冰箱中保存待测。用放免方法测 定血浆皮质酮水平(中国科学院上海原子能研究所)。皮质酮放免试剂盒购于DSL(美国)， 灵敏度为2.35ng/ml，批间和批内的变异系数分别为5.7%和4.4%。
1.7 统计方法 实验结果用SPSS 15.0统计软件分析。实验数据首先进行正态分布和方差 齐性检验；方差齐性实验数据采用双因素方差分析(地区：1.平原，2.高原；应激：0.无应 激，a.心理应激2次/天，b.心理应激2次/天×2天)；组间比较采用单因素方差分析。
2 结 果
2.1 各组间皮质酮水平的比较 地区因素主效应有显著性意义(F=38.45，P
2.2 各组间海马细胞外液NE含量的比较 地区因素(F=38.34，P[8]，而本实验的心理 应激大鼠 血浆皮质酮水平都显著高于对照组，心理应激模型制作成功。低压低氧环境中大鼠血浆皮质 酮水平也显著高于对照组，说明低压低氧环境中的大鼠也处于一种应激状态；进舱前施加心 理应激的大鼠，血浆皮质酮水平未进一步升高，说明低压低氧环境已经使机体的HPA轴功能 达到高激活状态，这与有关的报道相类似[9]。
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在大脑中，应激反应的重要组成成份是激活脑内单胺递质系统。在中枢单胺系统中，NE和5- HT系统被认为是适应应激反应的更重要的中枢神经递质网络。海马是NE含量丰富的脑区，并 且海马腹侧接受蓝斑大量的NE能神经元投射，突触前的肾上腺受体调节NE和5-HT的释放；海 马的CA1和CA2区域，接受大量的5-HT神经元神经支配，5-HT通过海马环路调节应激反应[10]。
由于低氧暴露后，脑内的单胺递质一般在24h后才恢复到基础水平[11]，因此，本 研究的单胺 递质含量变化，基本反映了低氧处理后大鼠脑内单胺递质的含量改变。单独给予低氧应激24 h后，大鼠海马细胞外液中NE的含量明显降低，可能是由于酪氨酸羟化酶的活性降低[ 11]，导致NE含量的减少，说明NE对低氧敏感[12]。随着入舱前给予应激强度的 增加，Ps2+Hy组的 大鼠海马细胞外液中的NE含量显著高于Hy组。说明一定强度的心理应激可增加低氧环境下的 机体交感神经活性，增加NE的释放，其对中枢NE的影响可能有别于低氧。
, 百拇医药
单独给予低氧应激后，大鼠海马细胞外液中5-HT的含量显著升高。由于在低氧环境下，色氨 酸羟化酶的活性也是降低的[11]，海马内的5-HT含量仍然增高，可能是由于色氨酸 羟化酶的 活性在低氧环境下没有完全被抑制，5-HT的重摄取被抑制，低氧仍能刺激5-HT神经元释放一 定的5-HT。增加心理应激的强度，不能进一步增加海马内的5-HT含量，提示低氧环境已经使 机体的5-HT神经元释放达到极限或者可能是心理应激的强度不足以引起5-HT神经元进一步释 放5-HT。由于海马接受的5-HT神经元神经末梢含有抑制神经递质释放的GABA神经纤维，对应 激反应起到负反馈调节作用[13]，提示模拟低压低氧环境下海马细胞外液中的5-HT 含量的升 高是机体的适应性反应，不同于低氧对海马NE系统的影响；同时也提示5-HT系统和NE系统是 机体适应应激反应的主要神经递质，至少在海马环路内。, 百拇医药(邓自和 马文涛 杨来启 张 彦 胡淑芳 何 明 吴兴曲)
1.4 推挽灌流法收集海马细胞外液 各实验组处理后的大鼠，立即在戊巴比妥钠(40mg/kg ，ip)麻醉后，固定于立体定位仪上(江湾I型脑立体定位仪，上海)，按Paxinos[6]等大鼠 立体定位图谱，确定右侧腹侧海马坐标，牙科钻开颅，插入自制推挽灌流套管(其外管和内 管的外径分别为1.0mm和0.6mm)至海马腹侧(Bregma后5.2mm、向右旁开5.0mm、深7.0mm)。 灌流液为人工脑脊液(aCSF)(145mM NaCl，2.7mM KCl，1mM MgCl2，2mM Na2HPO4和1.2mM Ca Cl2(pH 7.2~7.4)，由恒速微量注射泵(AJ5805，上海)持续灌流，灌流速度为10.0uL/min。 持续收集40min，收集管周围用碎冰降温，收集过程在避光条件下进行，前20min灌注液弃用 ，后20min时灌注液作为检测液，灌流液用0.22um微孔膜过滤后，立即放入-70℃冰箱保存 待测。
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1.5 高效液相色谱-电化学测定
1.5.1 仪器 美国Waters高效液相色谱仪；M460电化学检测器；M745B数据处机；510泵；U 6K进样器。
1.5.2 试剂 标准品为去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)、5-羟吲哚乙酸( 5- HIAA)、高香草酸(HVA)、3-氧基4羟基苯乙酸(DOPAC)均由美国Sigma公司提供；3，4-二羟 苄胺(DHBA)作为内标也由Sigma公司提供。0.1mol/LHCL将上述标准品配制成100μg/L贮液 ，置于-70℃保存。标准工作液：取适量贮液，以0.1mol/LHCl稀释至所需要浓度(现用现配) 。庚烷磺酸钠离子对试剂为Sigma产品，甲醇为优级纯，其它试剂均为分析纯，实验用水为 超纯水。
1.5.3 检测 每次直接进样50μl，进行检测，具体方法见程连弟等[4]的报道。 具体的仪器及检测方法见马文涛[2]及程连弟[7]等的报道。
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1.6 血浆皮质酮水平的测定 推挽灌流结束后，心脏插管取血，置于20U/ml肝素抗凝的试 管混匀，于4℃、3000r/min条件下离心分离血浆，于-20℃冰箱中保存待测。用放免方法测 定血浆皮质酮水平(中国科学院上海原子能研究所)。皮质酮放免试剂盒购于DSL(美国)， 灵敏度为2.35ng/ml，批间和批内的变异系数分别为5.7%和4.4%。
1.7 统计方法 实验结果用SPSS 15.0统计软件分析。实验数据首先进行正态分布和方差 齐性检验；方差齐性实验数据采用双因素方差分析(地区：1.平原，2.高原；应激：0.无应 激，a.心理应激2次/天，b.心理应激2次/天×2天)；组间比较采用单因素方差分析。
2 结 果
2.1 各组间皮质酮水平的比较 地区因素主效应有显著性意义(F=38.45，P
2.2 各组间海马细胞外液NE含量的比较 地区因素(F=38.34，P[8]，而本实验的心理 应激大鼠 血浆皮质酮水平都显著高于对照组，心理应激模型制作成功。低压低氧环境中大鼠血浆皮质 酮水平也显著高于对照组，说明低压低氧环境中的大鼠也处于一种应激状态；进舱前施加心 理应激的大鼠，血浆皮质酮水平未进一步升高，说明低压低氧环境已经使机体的HPA轴功能 达到高激活状态，这与有关的报道相类似[9]。
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在大脑中，应激反应的重要组成成份是激活脑内单胺递质系统。在中枢单胺系统中，NE和5- HT系统被认为是适应应激反应的更重要的中枢神经递质网络。海马是NE含量丰富的脑区，并 且海马腹侧接受蓝斑大量的NE能神经元投射，突触前的肾上腺受体调节NE和5-HT的释放；海 马的CA1和CA2区域，接受大量的5-HT神经元神经支配，5-HT通过海马环路调节应激反应[10]。
由于低氧暴露后，脑内的单胺递质一般在24h后才恢复到基础水平[11]，因此，本 研究的单胺 递质含量变化，基本反映了低氧处理后大鼠脑内单胺递质的含量改变。单独给予低氧应激24 h后，大鼠海马细胞外液中NE的含量明显降低，可能是由于酪氨酸羟化酶的活性降低[ 11]，导致NE含量的减少，说明NE对低氧敏感[12]。随着入舱前给予应激强度的 增加，Ps2+Hy组的 大鼠海马细胞外液中的NE含量显著高于Hy组。说明一定强度的心理应激可增加低氧环境下的 机体交感神经活性，增加NE的释放，其对中枢NE的影响可能有别于低氧。
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单独给予低氧应激后，大鼠海马细胞外液中5-HT的含量显著升高。由于在低氧环境下，色氨 酸羟化酶的活性也是降低的[11]，海马内的5-HT含量仍然增高，可能是由于色氨酸 羟化酶的 活性在低氧环境下没有完全被抑制，5-HT的重摄取被抑制，低氧仍能刺激5-HT神经元释放一 定的5-HT。增加心理应激的强度，不能进一步增加海马内的5-HT含量，提示低氧环境已经使 机体的5-HT神经元释放达到极限或者可能是心理应激的强度不足以引起5-HT神经元进一步释 放5-HT。由于海马接受的5-HT神经元神经末梢含有抑制神经递质释放的GABA神经纤维，对应 激反应起到负反馈调节作用[13]，提示模拟低压低氧环境下海马细胞外液中的5-HT 含量的升 高是机体的适应性反应，不同于低氧对海马NE系统的影响；同时也提示5-HT系统和NE系统是 机体适应应激反应的主要神经递质，至少在海马环路内。, 百拇医药(邓自和 马文涛 杨来启 张 彦 胡淑芳 何 明 吴兴曲)