白假丝酵母菌在部分宫颈病变中的表达情况(1)
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【中图分类号】R711.32【文献标识码】A【文章编号】1005-2720(2009)05-0178-03
【摘要】目的：对宫颈炎、宫颈尖锐湿疣、宫颈CIN病变中假丝酵母菌、白假丝酵母菌和高危型HPV16/18的表达情况进行比较，探讨HPV感染、宫颈癌前病变与假丝酵母菌、白假丝酵母菌的相关性。方法：选择241例超薄液基细胞学检查结果异常并有病理诊断的患者组织，采用RT-PCR方法检测白假丝酵母菌和高危型HPV16/18的表达情况。结果：高危型HPV16/18感染率在CIN组明显高于宫颈炎组(P<0.0)，并且随CIN级别的升高而升高，白假丝酵母菌在宫颈炎组中的表达显著高于CIN组(P<0.05)，表达差异均有统计学意义。但在CIN患者中假丝酵母菌阳性率差异并无统计学意义。结论：高危型HPV与CIN有相关性，正常寄生状态存在的假丝酵母菌、白假丝酵母菌与CIN及HPV尚无发现有明显相关性。
【关键词】白假丝酵母菌；HPV；CIN；宫颈病变
宫颈癌是由癌前病变-宫颈上皮内瘤变逐步发展过来的，目前世界已经公认，HPV感染是导致宫颈癌发生的主要原因。近年来，性传播疾病尤其是HPV感染在世界范围内已十分普遍，并且性传播疾病多重感染的发病率越来越高。人们发现，宫颈癌的致病性也与女性生殖道多重感染相关。
假丝酵母菌是人体的正常菌群，通常不会引起疾病，但是在免疫系统有损害或受到抑制的个体，就会引起真菌感染，对于女性来说，最常见的就是VVC[1]，75%的女性一生中至少患过一次VVC。假丝酵母菌属条件致病菌，对人体致病的有9种，其中致病力最强和最常见的是白假丝酵母菌。Abu-Elteen等发现，在356例阴道炎患者中，白假丝酵母菌比例为43.1%[2]。大量研究已经证实，假丝酵母菌的致病性是与它的胞外酶或酸性蛋白酶(candida albican acid proteinase，CAP)荚膜和其黏附性、水性牙管生成有关[3]。也有不少研究发现了机体的细胞免疫和体液免疫系统与假丝酵母菌致病密切相关[4，5]。
由于假丝酵母菌感染、HPV感染及宫颈癌前病变可能均与机体免疫力有相关性，设想三者之间可能存在一定相关性，假丝酵母菌感染可能是宫颈癌前病变或宫颈癌的致病因素。故本文通过临床病例研究探讨假丝酵母菌、白假丝酵母菌与HPV感染及癌前病变的关系。
1 材料方法
1.1 标本来源：从2005年1月～2008年1月在郑州市妇幼保健院妇科门诊就诊患者中，选择241例超薄液基细胞学检查(liquid-based/thin-layer preparation)结果异常并有病理诊断的患者。组织病理学按照Richart[6]的宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)系统进行诊断。按照病理学诊断分为宫颈炎组90例；宫颈湿疣组40例；CIN组111例，包括：CINⅠ42例，CINⅡ40例，CINⅢ 29例。
1.2 基因组DNA提取：从宫颈细胞学检测剩余的液基薄片保存液提取脱落细胞的基因组DNA，使用血液、动物组织基因组DNA提取试剂盒置于1.5ml tube进行PCR扩增，检测DNA提取是否成功。PCR反应体系总体积为50μl，其中包括5μl基因组DNA，10×PCR扩增缓冲液5μl、2.0mmol/L dNTP4μl、25ng/μl的βactin引物(上下游引物合液)2μl。同时设阴性对照和阳性对照(培养的cos细胞基因组DNA的提取物为阳性对照，阴性为蒸馏水)。PCR反应条件为94℃ 45s、55℃ 45s、72℃ 60共35次循环。扩增产物300bp。
2.3 HPV16/18DNA检测：HPV16/18引物序列为5’TCAGAGGTAACCATAGAGCCAC 3’及5’TGGTGCCATGGACTTTACTACA 3’扩增产物为295bp。PCR反应体系总体积为50μl，包括5μl基因组DNA、10×PCR扩增缓冲液5μl、2.0mmol/L dNTP4μl、2U/μl Taq酶1μl、2.0mmol/L MgCl2溶液2μl、25ng/μl的上下游引物合液2μl(分别为通用型HPV引物MY09/11和HPV16/18引物)，同时设阴性和阳性对照(阳性为HPV及HPV16/18阳性样本，阴性为蒸馏水)。PCR反应条件为94℃ 60s、55℃ 45s、72℃ 40s，共循环35周期。扩增产物在2%琼脂糖电泳30min，在紫外灯下观测结果并照相，判定PCR扩增结果。
2.4 假丝酵母菌的检测：用NS5’AACTTAAAGGAATTGACGGAAG和NS6 GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC做引物检测，可扩增出一个310bp的真菌界高度保守的特异性rDNA片段。PCR反应体系总体积为50μL，PCR反应条件为94℃ 6min预热、94℃ 30s、58℃1min、72℃ 5min，循环25周期，最后72℃ 10min。
2.5 白假丝酵母菌的检测：用5-5’GAC ACC ACC ATG TCT TCT TAC 3’；5’GCA GAT TCT CCA GCT GGT TCG TCA 3’做引物，扩增产物为317bp。PCR反应条件为95℃ 6min预热、95℃ 30s、55℃ 1min、73℃ 5min，循环25周期，最后72℃ 10min。
2.6 统计学处理：全部数据均录入Excel表格，行分组分析。部分数据录入SPSS13.0软件行t检验和χ2检验。
2 试验结果
2.1 HPV检测：各组HPV16/18 DNA检测阳性结果图片，见图1。
2.2 假丝酵母菌及白假丝酵母菌检测结果：见图2、3及表1。
如图2，除9号其余所有标本均在310bp出现目的条带，提示均有假丝酵母菌。
如图3，只有7号标本在317bp出现目的条带，提示有白假丝酵母菌。
3 讨论
本文结果表明高危型HPV16/18感染率在CIN组明显高于宫颈炎组(P<0.05)，并且随CIN级别的升高而升高，进一步证实高危型HPV与CIN的相关性 ......
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