氯沙坦拮抗急性胰腺炎胰腺纤维化启动的研究(2)
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近年来慢性胰腺炎在人群中的发病率逐年上升，其反复急性发作最终可发展成为胰腺纤维化甚或癌变。胰腺星形细胞(pancreatic satellite cells，PSCs)的激活则被认为是引起这种病理变化的关键事件。PSCs能分泌细胞外基质(extracellular matrix，ECM)促进组织修复并诱导纤维化改变，并通过分泌基质金属蛋白酶参与ECM成分分解代谢的调节[1]。活化的PSC细胞转化为肌成纤维细胞，并表达α-SMA蛋白，故α-SMA的检测可以作为反映PSC细胞活化程度的一项指标，而TGF-β1可能在激活胰腺星形细胞及促进胰腺纤维化中发挥重要作用。据研究肾素-血管紧张素系统(reno-angiotensin system，RAS)也存在于胰腺组织内，并在慢性胰腺炎纤维化中有重要影响，其途径就是通过抑制PSCs的激活及增生，从而延缓纤维化的进展。本研究采用刺激胰腺分泌并阻断胰腺导管的方法(hyperstimulation and obstruction pancreatitis，SHOP)复制SD大鼠胰腺炎动物模型，应用免疫组化、RT-PCR技术并结合光镜、大体观察等测定方法从组织细胞、基因等水平对急性胰腺炎大鼠纤维化启动在AT-Ⅱ受体拮抗剂的干预下的改变情况进行初步探讨，为胰腺纤维化的临床研究提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 动物分组及模型：清洁级雄性SD大鼠35只，体重(220±30)g，由第三军医大学第三附属医院提供。利用随机数字表随机分为假手术组、对照组和治疗组，对照组和治疗组设模型制备后72h、120h两个时相点，每组各7只大鼠。模型制备采用SHOP方法制备，即雨蛙素对胰液强刺激分泌并胰腺导管阻断的方法。具体方法如下：对大鼠麻醉成功后，正中开腹。循十二指肠系膜部可见胆总管，分离胆总管并结扎。然后循胆总管逆行寻找肝总管汇集部，再次结扎胆总管。结扎完毕后，腹腔注射雨蛙素(50μg/kg)。分层缝合大鼠腹壁，待清醒后移送SPF饲养室，自由进食水。然后于24h和48h按上述剂量重复腹腔注射雨蛙素。假手术组进行开腹并腹腔注射生理盐水然后关腹，不进行结扎操作。假手术组及对照组大鼠均给予生理盐水0.6ml/d灌胃；氯沙坦治疗组大鼠给予氯沙坦30mg/kg/d灌胃时间从术前3d始，至时间点止。
1.2 观察项目
1.2.1 光镜观察：大鼠胰腺组织取材后经4%甲醛固定、石蜡包埋并行常规HE染色，在光镜下观察其组织学变化。
1.2.2 免疫组化检测观察：免疫组化采用SABC法，小鼠抗大鼠α-SMA单克隆抗体、兔抗大鼠Collagen-Ⅰ单克隆抗体及SABC试剂盒等均为为武汉博士德公司产品。组织切片常规脱蜡至水，30%双氧水室温灭活5～10min以消除内源性过氧化物酶，微波修复抗原10min，再抗原修复液修复10min，5%BSA封闭液室温20min封闭非特异性抗原。滴加一抗，37℃ 1h，然后滴加二抗，37℃ 20min，SABC 37℃孵育20min，DAB显色，镜下控制显色时间，苏木素复染、中性树胶封片后镜下观察。以PBS代替一抗进行阴性对照。
1.2.3 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)：采用两步法进行。用RNAex Reagent(Watson公司提供)从液氮冻存的胰腺组织中提取组织总RNA，并以MMLV第一链cDNA合成试剂盒(上海生工)进行逆转录，操作步骤按试剂盒说明书进行。PCR反应采用高保真即用PCR扩增试剂盒(上海生工)进行，模板cDNA取5μl，上下游引物浓度各为10mmol/L。对目的基因TGF-β1、Collagen-Ⅰ(α1)和内参照基因β-actin cDNA进行扩增所用的引物由上海博亚公司合成，序列如下：
TGF-β1(扩增产物片段大小为502bp)：上游引物5′-GCGACTCCTGCTGCTTTCTC-3′，下游引物5′-GTTGTTGCGGTCCACCATTA-3′。
Collagen-Ⅰ(α1片段大小为122bp)：上游引物5′-CCTGGAAGAGATGGTGCT-3′，下游引物5′-CCATTCTTGCCAGCAGGAC-3′。
β-actin(扩增产物片段大小为394bp)：上游引物5′-CTGCCGCATCCTCTTCCTC-3′，下游引物5′-CTCCTGCTTGCTGATCCACAT-3′。
PCR反应热循环条件如下：94℃ 45s，55℃ 30s，72℃延伸60s，共35个循环。反应结束后在72℃下延伸10min。PCR反应产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结束后在Chemi Imager 5500型凝胶成像仪下观察照相。
2 结果
2.1 急性胰腺炎大鼠胰腺组织的组织学改变：假手术组大鼠胰腺组织大体为色泽润白外观，无充血水肿，无黄染和坏死，未见明显病变，而对照组和治疗组则见胰腺表面黄染，组织充血水肿明显，局部存在隆起样病变，胰腺包膜可见散在瘀斑瘀点，治疗组较对照组区别在于治疗组胰腺表面瘀点瘀斑较少，组织充血较均匀，充血点显细腻。光镜下改变假手术组腺管无扩张改变，腺泡排列规整的组成许多小叶，小叶间为少量纤维结缔组织分隔，部分小叶内可见胰岛结构。对照组、治疗组大鼠胰腺组织可见明显充血、水肿和炎症细胞浸润，部分腺泡破坏，导管扩张，间质纤维结缔组织成分增多。两组的72h、120h相比，胰腺组织炎症反应进行性加重，小叶间距明显增宽，导管扩张及间质纤维化亦呈加重趋势。组织学改变未进行量化统计。
2.2 免疫组化检测观察α-SMA、Collagen-Ⅰ蛋白的表达
2.2.1 α-SMA的免疫组化检测结果及分析：本研究在假手术组大鼠胰腺组织中仅观察到α-SMA蛋白存在于胰腺组织内的血管壁，偶见个别PSC细胞胞浆着染，和既往文献描述相同。对照组、治疗组大鼠则在胰腺内的血管壁，胰腺小叶间及小叶内的间质中均检测到α-SMA蛋白的表达，呈散在分布的淡黄色及黄色，染色范围不均，深浅不一，形状不规则。无论对照组和治疗组，120h组较之72h组均可见α-SMA的表达逐渐增强，经分析有统计学上的差异 ......
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