三七总皂苷对铝暴露脑微血管内皮细胞胞质紧密黏连蛋白1表达的影响(2)
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2.3.2 引物合成 通过检索NCBI(美国国家生物技术信息中心)获得小鼠ZO-1 mRNA基因序列，引物交由北京奥科鼎盛生物科技有限公司设计并合成。5’ primer：AGGACACCAAAGCATGTGAG， 3’primer：GGCATTCCTGCTG GTTACA，扩增片段长度86 bp；内参β-actin：Forward 5'-AGGCCAACCGTGAAAAGATG-3'，Reverse 5'-TGGCGTGAGGGAGAGCATAG-3'，扩增片段长度185 bp。
2.3.3 反应体系及反应条件 总反应体系25 ?L，其中2×mix 12.5 ?L，无RNA酶水5.5 ?L，cDNA 5 ?L，上游引物1 ?L
(10 ?mol/L)，下游引物1 ?L(10 ?mol/L)，反应条件：95 ℃、10 min预变性；然后95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40次循环。反应结束计算机自动计算CT值。
2.3.4 扩增效率标准曲线、熔解曲线和扩增曲线 每个引物均把CDNA按倍比稀释5次(1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32)，每浓度3个复孔，以CT值为纵坐标、稀释倍数的对数为横坐标建立标准曲线。观察熔解曲线和扩增曲线，了解目的基因扩增中是否有非特异性扩增产物及引物二聚体。
2.4 Western blot
细胞以1×105细胞/mL接种于6孔板，培养48 h，细胞裂解液(15 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，0.2% TritonX-100，150 mmol/L NaCl)裂解细胞 ......
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