止消通脉宁对TGF—β1诱导的人肾小管上皮细胞CTGF、PAI—1、MMP—9mRNA表达的影响(2)
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参见附件。
2.3 分组
将传代培养的HK-2细胞分为6组。空白对照组：DMEM/F12培养液；单纯TGF-β1诱导组：DMEM/F12培养液+10 ng/mL TGF-β1；空白血清对照组：DMEM/F12培养液+10 ng/mL TGF-β1+10%空白血清；干预1组：DMEM/F12 培养液+10 ng/mL TGF-β1+10%低剂量止消通脉宁药物血清；干预2组：DMEM/F12培养液+10 ng/mL TGF-β1+10%中剂量止消通脉宁药物血清；干预3组：DMEM/F12培养液+10 ng/mL TGF-β1+10%高剂量止消通脉宁药物血清。
2.4 人肾小管上皮细胞结缔组织生长因子等纤维细胞因子表达测定
细胞以6 000个/孔的密度接种于96孔板中，每孔200 ?L，每组设3个复孔，培养过夜。
吸弃细胞上清，加入无血清培养基同步化24 h。再次弃细胞上清，按照分组加入相应药品的培养液200 ?L，继续培养24 h。提取RNA进行PCR实验操作。
总RNA的抽提：用枪头吸尽培养基，向各孔中加入125 ?L×2的Washing Buffer。用枪头吸尽Cell AmpTM Washing Buffer，后向各孔中加50 ?L Processing溶液，反复吹打Processing液后，移至微量离心管中。75 ℃水浴5 min，分装得到的细胞裂解液。将提取出的总RNA进行完整性分析及纯度测定。
反转录反应：根据RT反应体系(见表1)，于PCR管中相应体积的5×PrimeScriptTM Buffer ......
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