痛泻要方对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织病理形态及血清中相关因子含量的影响(1)
摘要：目的 观察痛泻要方对溃疡性结肠炎(UC)大鼠结肠组织病理形态及血清中相关因子的影响，探讨其作用机制。方法 60只SPF级Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、柳氮磺胺吡啶(SASP)组及痛泻要方低、中、高剂量组，除空白组外，其余各组大鼠均以2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇灌肠法制备UC大鼠模型，同时，痛泻要方低、中、高剂量组分别按原药材11、22、44 g/kg剂量灌胃，SASP组按0.3 g/kg剂量灌胃，灌胃体积均为10 mL/kg，空白组、模型组灌服等体积生理盐水，持续3周。HE染色观察大鼠结肠组织病理形态并评分，采用ELISA法检测大鼠血清白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF-α)和IL-4水平。结果 HE染色显示，各治疗组结肠组织病理形态明显改善；与空白组比较，模型组大鼠血清IL-1β、TNF-α含量均明显升高，IL-4含量显著下降(P<0.05，P<0.01)；与模型组比较，痛泻要方高、中、低剂量组大鼠血清IL-1β、TNF-α水平降低，而IL-4水平明显升高(P<0.05，P<0.01)。结论 痛泻要方通过下调促炎因子IL-lβ、TNF-α的表达，升高抗炎因子IL-4的表达，调节肠道异常免疫反应、抑制炎症反应，修复溃疡，进而防治UC。
关键词：痛泻要方；溃疡性结肠炎；白细胞介素-1β；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素-4；大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2013)04-0041-03
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是常见的炎症性肠病，临床以腹痛腹泻、黏液脓血便持续或反复发作为主要症状，具有癌变倾向。该病发病原因及机制尚不明确，目前尚缺乏满意的治疗方法。我们临床上用痛泻要方加减治疗该病，取得了显著疗效[1]。前期药效学研究表明，痛泻要方对UC大鼠模型肠黏膜炎症有较好的改善作用[2]，但其作用机制不清。本实验进一步探讨痛泻要方对实验性UC大鼠结肠组织病理形态及白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF-α)和IL-4的影响，探讨其作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级Wistar大鼠60只，体质量(180±10)g，雌雄各半，甘肃中医学院科研实验动物中心提供，SPF级动物质量合格证号：SCXKC(甘)2004-0006；SPF级实验设施合格证号：SYXKC(甘) 2004-0006-0001561。
1.2 试剂
蛋白标准液、考马斯亮蓝溶液(20090825)均购自南京建成生物工程公司；2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)购于北京邦定泰克生物技术有限公司，美国Sigma公司生产；大鼠IL-β、TNF-α、IL-4检测试剂盒购自深圳市达科为生物技术有限公司。
1.3 仪器
biorad iMark酶标仪(美国BLO-RAD公司)，CT14RD高速冷冻离心机(天美科技有限公司)，303-2型恒温培养箱(北京科伟永鑫实验设备仪器公司)。
1.4 药物
按照《丹溪心法》痛泻要方原方比例取炒陈皮、炒白术、炒白芍、防风，用8倍量70%的乙醇每次回流2 h，提取3次，得醇提取液和醇提取药渣。合并3次醇提取液，滤过，滤液减压回收乙醇后得醇提取浓缩液，醇提取浓缩液干燥得干膏，干膏粉碎成细粉，加入挥发油。实验用不含赋形剂的浸膏，冰箱保存备用。柳氮磺胺吡啶(SASP)，上海三维制药有限公司生产。
2 实验方法
2.1 造模
参考文献[3]方法，采用TNBS/乙醇溶液灌肠法制作UC大鼠模型：将大鼠禁食(不禁水)24 h，用10%水合氯醛腹腔麻醉(0.3 mL/100 g)后，一次性将TNBS/乙醇溶液(100 mg/kg TNBS+50%乙醇0.25 mL)用橡胶输液管轻缓注入大鼠距肛门约7～8 cm深的肠腔内，留置数分钟，然后抽取适量空气，采用同样方法注入肠腔，防止溶液外漏，让动物保持平躺状态，自然清醒。
2.2 分组与给药
将实验动物分为空白组、模型组、SASP组及痛泻要方低、中、高剂量组，每组10只。除空白组外，均以100 mg/kg TNBS+50%乙醇0.25 mL混合试剂灌肠。痛泻要方低、中、高剂量组分别按11、22、44 g/kg剂量灌胃(按照临床成人用量的5、10、20倍折算)，SASP组按0.3 g/kg剂量灌胃，灌胃体积均为10 mL/kg，空白组、模型组灌服等体积生理盐水。各组于造模后第2日开始灌胃，每日1次，连续21 d。处理 3周后，乙醚麻醉后于股动脉采血，室温静置10～20 min，3 000 r/min离心10 min，收集上清，检测指标。脱颈处死大鼠，剪取病变最明显处结肠组织5～8 cm，用冷PBS清洗结肠，部分结肠组织以4%中性多聚甲醛固定，做病理切片，HE染色，光镜观察。
2.3 结肠组织病理学评分标准
参考结肠病理组织学评分标准[4]，由2位富有经验的病理教研室老师进行双盲评分。①炎细胞浸润：无0分，轻度1分，重度2分；②浸润深度：黏膜层1分，黏膜和黏膜下层2分，结肠全层3分；③溃疡深度：无0分，上皮1分，黏膜固有层2分，黏膜肌层3分。
2.4 指标检测
采用双抗体夹心ELISA法测定IL-1β、TNF-α、IL-4，严格按试剂盒要求操作。在检测波长450 nm和校正波长620 nm处同时读板，通过标准曲线，计算各样本含量。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析，实验数据以—x±s表示，组间比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 一般状态, 百拇医药(朱向东等)
关键词：痛泻要方；溃疡性结肠炎；白细胞介素-1β；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素-4；大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2013)04-0041-03
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是常见的炎症性肠病，临床以腹痛腹泻、黏液脓血便持续或反复发作为主要症状，具有癌变倾向。该病发病原因及机制尚不明确，目前尚缺乏满意的治疗方法。我们临床上用痛泻要方加减治疗该病，取得了显著疗效[1]。前期药效学研究表明，痛泻要方对UC大鼠模型肠黏膜炎症有较好的改善作用[2]，但其作用机制不清。本实验进一步探讨痛泻要方对实验性UC大鼠结肠组织病理形态及白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF-α)和IL-4的影响，探讨其作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级Wistar大鼠60只，体质量(180±10)g，雌雄各半，甘肃中医学院科研实验动物中心提供，SPF级动物质量合格证号：SCXKC(甘)2004-0006；SPF级实验设施合格证号：SYXKC(甘) 2004-0006-0001561。
1.2 试剂
蛋白标准液、考马斯亮蓝溶液(20090825)均购自南京建成生物工程公司；2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)购于北京邦定泰克生物技术有限公司，美国Sigma公司生产；大鼠IL-β、TNF-α、IL-4检测试剂盒购自深圳市达科为生物技术有限公司。
1.3 仪器
biorad iMark酶标仪(美国BLO-RAD公司)，CT14RD高速冷冻离心机(天美科技有限公司)，303-2型恒温培养箱(北京科伟永鑫实验设备仪器公司)。
1.4 药物
按照《丹溪心法》痛泻要方原方比例取炒陈皮、炒白术、炒白芍、防风，用8倍量70%的乙醇每次回流2 h，提取3次，得醇提取液和醇提取药渣。合并3次醇提取液，滤过，滤液减压回收乙醇后得醇提取浓缩液，醇提取浓缩液干燥得干膏，干膏粉碎成细粉，加入挥发油。实验用不含赋形剂的浸膏，冰箱保存备用。柳氮磺胺吡啶(SASP)，上海三维制药有限公司生产。
2 实验方法
2.1 造模
参考文献[3]方法，采用TNBS/乙醇溶液灌肠法制作UC大鼠模型：将大鼠禁食(不禁水)24 h，用10%水合氯醛腹腔麻醉(0.3 mL/100 g)后，一次性将TNBS/乙醇溶液(100 mg/kg TNBS+50%乙醇0.25 mL)用橡胶输液管轻缓注入大鼠距肛门约7～8 cm深的肠腔内，留置数分钟，然后抽取适量空气，采用同样方法注入肠腔，防止溶液外漏，让动物保持平躺状态，自然清醒。
2.2 分组与给药
将实验动物分为空白组、模型组、SASP组及痛泻要方低、中、高剂量组，每组10只。除空白组外，均以100 mg/kg TNBS+50%乙醇0.25 mL混合试剂灌肠。痛泻要方低、中、高剂量组分别按11、22、44 g/kg剂量灌胃(按照临床成人用量的5、10、20倍折算)，SASP组按0.3 g/kg剂量灌胃，灌胃体积均为10 mL/kg，空白组、模型组灌服等体积生理盐水。各组于造模后第2日开始灌胃，每日1次，连续21 d。处理 3周后，乙醚麻醉后于股动脉采血，室温静置10～20 min，3 000 r/min离心10 min，收集上清，检测指标。脱颈处死大鼠，剪取病变最明显处结肠组织5～8 cm，用冷PBS清洗结肠，部分结肠组织以4%中性多聚甲醛固定，做病理切片，HE染色，光镜观察。
2.3 结肠组织病理学评分标准
参考结肠病理组织学评分标准[4]，由2位富有经验的病理教研室老师进行双盲评分。①炎细胞浸润：无0分，轻度1分，重度2分；②浸润深度：黏膜层1分，黏膜和黏膜下层2分，结肠全层3分；③溃疡深度：无0分，上皮1分，黏膜固有层2分，黏膜肌层3分。
2.4 指标检测
采用双抗体夹心ELISA法测定IL-1β、TNF-α、IL-4，严格按试剂盒要求操作。在检测波长450 nm和校正波长620 nm处同时读板，通过标准曲线，计算各样本含量。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析，实验数据以—x±s表示，组间比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 一般状态, 百拇医药(朱向东等)
参见：首页 > 医疗版 > 疾病专题 > 消化内科 > 肠道疾病 > 结肠病 > 结肠炎 > 溃疡性结肠炎