复合因素对小鼠病毒性肝炎湿热证的影响(2)
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2.3.5 RNA反转录 取5 ?L RNA模板做反转录反应，反应体系如下：5×反转录buffer 4 μL[反转录buffer成分：50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，50 mmol/L KCl，4 mmol/L MgCl2，10 mmol/L DTT]，上游引物(10 pmol/?L)0.4 ?L，下游引物(10 pmol/?L) 0.4 ?L，dNTPs(10 mmol/?L)0.2 ?L，MMLV(200 U/?L)1 ?L， DEPC水9 ?L，RNA模板5 ?L，总体积20 ?L。反应条件：置于PE9600PCR仪37 ℃、1 h，然后95 ℃、3 min灭活，备用。
2.3.6 荧光定量PCR反应 反转录好的模板按以下反应体系进行PCR扩增：5×定量PCR buffer10 ?L[PCR buffer成分：10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，50 mmol/L KCl，2 mmol/L MgCl2)]；上游引物(10 pmol/?L)1 ?L；下游引物R(10 pmol/?L)1 ?L；探针probe(10 pmol/?L)1 ?L，Taq酶(5 U/?L)1 ?L(美国ABI公司)，dNTPs(10 mmol/L)(Sigma公司)1 ?L，cDNA 5 ?L，ddH2O 32 ?L，总体积50 ?L。反应条件：93 ℃、3 min，然后93 ℃、45 s，55 ℃、1 min，共40循环。反应结束后保存检测数据文件 ......
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