葛根芩连方抗Wa株轮状病毒的药效学研究(2)
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参见附件。
2 实验方法
2.1 细胞培养
MA104细胞在含10%胎牛血清、100 ?g/mL青霉素、100 ?g/mL链霉素的DMEM培养液中生长和传代。
2.2 病毒增殖
Wa株RV的增殖和滴度测定在MA104上进行。当细胞在培养瓶中生长至单层时接种RV。接种病毒前，细胞单层先用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7)洗1次，用无血清DMEM培养液洗2次。接种前，将原始病毒液从﹣80 ℃冰箱中取出，4 ℃溶解，37 ℃与10 ?g/mL胰酶作用30 min，将长成单层的MA104细胞用PBS冲洗2次。随后加入与胰酶孵育后的病毒液，接种病毒后的细胞维持液为无胎牛血清、含1 ?g/mL胰酶的DMEM培养液。接种病毒后的细胞放37 ℃ CO2培养箱(含5%CO2)中孵育，至病毒感染MA104细胞病变(CPE)达到+++时，将培养瓶放入-20 ℃冻存，再4 ℃融解，如此反复冻融3次，低温高速12 000 r/min离心取上清收获病毒液，再重复1次病毒在细胞中传代实验，收获病毒。分装，-80 ℃保存。
2.3 病毒感染性滴度测定
用MA104细胞在96孔培养板中进行(微量滴定法)。在用不含血清的DMEM培养液将其按照1∶10稀释成10﹣1、10﹣2、10﹣3……10﹣6等系列浓度，将培养成单层MA104细胞的96孔板用PBS冲洗2次，再将不同稀释度的病毒加入96孔细胞培养板中，25 ?L/孔，每个浓度重复8孔。设置正常对照细胞，37 ℃、5%CO2孵育2 h后吸取出病毒液，加入不含血清的细胞培养液 ......
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