咳喘宁对病毒诱发哮喘模型大鼠CD4+、CD8+T细胞内信号转导子和转录激活子6表达的影响(2)
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参见附件。
2.3 外周血单个核细胞的分离
造模完成当天,常规采取PBS对照组、模型组各10只大鼠外周静脉血,将肝素钠抗凝管中的血液移至离心管中,以1∶1的比例加入Hank’s液,室温下2000 r/min离心20 min。离心结束后,管内可见分4层:最上层是血浆,第2层是单核细胞,第3层是分离液,第4层是粒细胞及红细胞。毛细吸管吸出中间的膜层细胞,再次离心,洗涤2次,将细胞悬浮在含10% FCS的RPMI-1640培养基中,并调整细胞浓度为2×107/mL,加入24孔培养板,5%CO2、37 ℃条件下培养2 h,用37 ℃预热的RPMI-1640培养液轻柔洗2次,去除非黏附细胞,即获得贴壁的单个核细胞。
2.4 磁珠结合法分离CD4+、CD8+T淋巴细胞
①吸去离心管中最上层血浆,重悬血液与缓冲液1(PBS+EDTA)至初始量;②按洗涤的全血1 mL加入12 ?L CD4+、CD8+T
(5×106 CD4+、CD8+T cell Dynabeads)的比例加入;③于2~8 ℃孵育20 min,将试管置于磁力架上吸附2 min;④弃上清液,用缓冲液1的样本原始量重悬并洗3次结合珠子的细胞,并置于磁架中1 min;⑤重悬结合珠子的细胞,在初始样本中,每毫升全血中加100 ?L缓冲液2(1% FCS);⑥放置室温下45 min并摇匀,置于磁力架上1 min;⑦移去上清液,把释放的细胞置于一新的试管,在500 ?L缓冲液2中洗2~3次珠子并收集上清液;⑧洗涤分离的细胞重悬于10 mL的缓冲液2中 ......
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