咳喘宁对病毒诱发哮喘模型大鼠CD4+、CD8+T细胞内信号转导子和转录激活子6表达的影响(2)
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参见附件。
2.3 外周血单个核细胞的分离
造模完成当天，常规采取PBS对照组、模型组各10只大鼠外周静脉血，将肝素钠抗凝管中的血液移至离心管中，以1∶1的比例加入Hank’s液，室温下2000 r/min离心20 min。离心结束后，管内可见分4层：最上层是血浆，第2层是单核细胞，第3层是分离液，第4层是粒细胞及红细胞。毛细吸管吸出中间的膜层细胞，再次离心，洗涤2次，将细胞悬浮在含10% FCS的RPMI-1640培养基中，并调整细胞浓度为2×107/mL，加入24孔培养板，5%CO2、37 ℃条件下培养2 h，用37 ℃预热的RPMI-1640培养液轻柔洗2次，去除非黏附细胞，即获得贴壁的单个核细胞。
2.4 磁珠结合法分离CD4+、CD8+T淋巴细胞
①吸去离心管中最上层血浆，重悬血液与缓冲液1(PBS+EDTA)至初始量；②按洗涤的全血1 mL加入12 ?L CD4+、CD8+T
(5×106 CD4+、CD8+T cell Dynabeads)的比例加入；③于2～8 ℃孵育20 min，将试管置于磁力架上吸附2 min；④弃上清液，用缓冲液1的样本原始量重悬并洗3次结合珠子的细胞，并置于磁架中1 min；⑤重悬结合珠子的细胞，在初始样本中，每毫升全血中加100 ?L缓冲液2(1% FCS)；⑥放置室温下45 min并摇匀，置于磁力架上1 min；⑦移去上清液，把释放的细胞置于一新的试管，在500 ?L缓冲液2中洗2～3次珠子并收集上清液；⑧洗涤分离的细胞重悬于10 mL的缓冲液2中 ......
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