四神丸对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织中核转录因子κB p65基因和蛋白表达的影响(2)
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采取经典的SABC法，将固定好的石蜡切片常规脱蜡至水。每张切片滴加3%H2O2，室温放置10 min。将切片浸入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)中进行抗原热修复，自然冷却至室温，滴加5%BSA封闭液，室温20 min。分别滴加NF-κB p65一抗，4 ℃冰箱过夜。滴加生物素化山羊抗兔IgG，在37 ℃培养箱中孵育20 min。滴加试剂SABC，在37 ℃培养箱中孵育20 min。DAB显色剂，苏木素轻度复染3 min；经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。在显微镜下观察结果，拍片。染色对照：同一组片中，用PBS代替一抗作孵育，其余步骤同上。
NF-κB p65蛋白主要表达于大鼠结肠组织中的肠道黏膜及黏膜下层，以胞浆为主。NF-κB p65表达阳性为胞质呈黄绿颗粒染色，颜色越深则表达越强，未出现黄绿颗粒者为阴性。采用BI-2000图像分析系统之免疫组化分析系统，随机选取5个视野，测阳性细胞平均灰度值，灰度值大，蛋白表达多，反之则表达少。
2.6 RT-PCR法检测核转录因子κB p65基因表达
总RNA的提取采用经典的Trizol法，应用Bio-RAd核酸定量分析仪测定总RNA的浓度和纯度，确保2.0>A260/A280>1.8。参照逆转录试剂盒说明书进行逆转录，合成cDNA，用cDNA模板对大鼠内参照β-actin及NF-κB p65基因分别进行PCR扩增，引物由金唯智生物科技北京有限公司合成，内参照β-actin引物序列：上游引物为5’-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3’，下游引物为5’-AAGGGTGTAAAACG CAGCTC-3’，扩增产物长度292 bp；NF-κB p65引物序列：上游引物为5’-GAGCAAGCCATTAGCCAGCG-3’，下游引物为5’-CACGGT TATCAAAAATCGGA-3’，产物长度173 bp ......
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