益气健脾中药对脾气虚大鼠神经肽Y、血管活性肠肽和丝裂原活化蛋白激酶14基因表达的影响(2)
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参见附件。
反转录合成模板cDNA：在0.5 mL去酶管中加入总RNA 5 μg、15×Oligo dT 1 μL、Random Primer 1 μL，加Nuclease-Free Water至10 μL；70 ℃变性5 min，冰上放置5 min以上；加入逆转录GoScriptTM 5×Reaction Buffer 4 μL，MgCl2(25 mmol/L)2 μL，PCR Nucleotide Mix(10 mmol/L)1 μL，Recombinant Rnasin Ribonuclease inhibitor 0.5 μL，GoScriptTM Reverse Transcriptase 1 μL，Nuclease-Free Water至10 μL，总体积为20 μL。混匀配制的反应混合物，短暂离心后25 ℃温浴5 min，42 ℃反应60 min，再70 ℃ 15 min灭活处理，所得单链cDNA放置于-20 ℃备用。
引物设计：从NCBI中查询目标基因ID及序列，由TAKARA公司[宝生物工程(大连)有限公司]设计和合成目标基因引物。见表1。
实时荧光定量PCR以β-actin作为内参基因，相同模板相同基因设3复孔、8次平行实验，得到各扩增反应的Ct值。反应体系据GoTaq 2-Step RT-qPCR试剂盒说明书配制。反应参数：预变性95 ℃、2 min，变性95 ℃、15 s，退火60 ℃、60 s，循环40 次，终末延伸65 ℃、5 s，95 ℃。连续检测荧光并记录扩增曲线，采用样点拟合法分析结果得到目的基因和β-actin的Ct值。用比较Ct值法计算相对表达量：ΔΔCt=(测试组目的基因Ct值-测试组内参基因Ct值)-(对照组目的基因Ct值-对照组内参基因Ct值) ......
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