红芪多糖对非酒精性脂肪肝大鼠脂代谢 及硬脂酰辅酶A去饱和酶1基因表达的影响(2)
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参见附件。
1.3主要试剂与仪器
RNAaso Plus(批号A7808-1)及PCR引物购于宝生物工程(大连)有限公司,反转录试剂盒(批号0000036802)购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司。BIOMATE 3S核酸蛋白测定仪,S1000TM普通PCR仪,Chemi DOC XRS+凝胶成像分析系统,美国BIO-RAD公司,CHEMIX180全自动生化分析仪(SYSMEX)。
2实验方法
2.1造模与分组
选取雄性SD大鼠42只,适应性喂养1周,随机分为空白组10只和实验组32只。空白组给予正常饲料,实验组给予高脂饲料造模,自由取食摄水,饲养8周,至第8周末随机处死模型大鼠2只断尾取血,检测TC、TG,取肝脏做病理切片以评价造模是否成功。造模成功后,空白组继续每日予正常饲料,实验组30只大鼠按体质量采用随机数字法分为模型组、阳性对照组、红芪多糖组,均喂食高脂饲料。
2.2给药
模型复制成功后,空白组和模型组给予10 mL/kg蒸馏水灌胃,红芪多糖组给予红芪多糖 150 mg/kg灌胃,阳性对照组给予维生素E 500 mg/kg灌胃,连续给药8周。
2.3样本采集与检测
各组大鼠末次给药后,禁食不禁水12 h,测体质量作记录,乌拉坦(1 g/kg)麻醉,股主动脉采血后静置约2 h,3500 r/min离心10 min,取上清液,-20 ℃冰箱保存备用。采血后脱颈处死大鼠,腹部正中切口开腹,取出完整肝脏,称重,-80 ℃冰箱保存,备用。
2.4指标测定
血脂HDL-c、LDL-c、TC、TG和血清ALT、AST等指标均采用全自动生化分析仪进行检测。
肝脏SCD-1基因表达量检测：取肝组织50 mg,按Trizol试剂盒提供的方法,提取总RNA,使用超微量分光光度计测定其纯度和含量,OD260/OD280在1.8～2.0之间说明所提取mRNA可用于下一步实验,取5 μg完整mRNA反转录成cDNA,以β-actin为内参进行PCR扩增,PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像分析系统下观察、拍照,IPP软件测其灰度值,与相应β-actin灰度之比表示SCD-1的表达量,引物序列见表1。
表1各基因引物序列及其产物长度
基因引物序列产物长度(bp)
β-actinForward5’-CCCGCGAGTACAACCTTCTTG-3’206
Reverse5’-ACCCATACCCACCATCACAC-3’
SCD-1Forward5’-ACCTTGCTCTGGGGGATATT-3’298
Reverse5’-TTCCGCCCTTCTCTTTGACA-3’
3统计学方法
采用SPSS19 ......
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