六郁同治法对动脉粥样硬化小鼠易损斑块胶原代谢的影响(2)
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1.3主要试剂与仪器
小鼠来源基质金属蛋白酶-9(MMP-9)一抗由美国Ab-Cam公司提供；二步法免疫组化检测试剂(鼠兔共用通用型二抗)、浓缩型DAB显色试剂盒、苦味酸-天狼星红染液均购自北京中杉金桥公司。日本Olympus CX31光学显微镜、偏振光显微镜；旋转式组织脱水机,德国莱卡公司,型号TP1020；组织包埋机,德国莱卡公司,型号EG1140H；轮转切片机,德国莱卡公司型号RM2135；图像分析软件,美国Image-Pro plus version 6.0(IPP6.0)。
1.4分组与造模
6～8周龄载脂蛋白E基因敲除小鼠予高脂饲料饲养,于30周龄左右可形成明显的易损斑块,包括斑块内出血、钙化甚至破裂。本实验将高脂饲料喂养小鼠至30周龄时,随机处死4只,取主动脉根部,10%中性福尔马林固定,常规脱水,石蜡包埋并切片,苏木素-伊红(HE)染色观察基础动脉粥样硬化程度,确定易损斑块形成后,随机分为模型组(B组)、辛伐他汀组(C组)、中药高剂量组(D组)、中药低剂量组(E组),每组10只。另取10只C57BL/6J小鼠作为正常组,喂以普通饮食。
1.5给药
根据成人每日用药临床推荐的常用剂量,按成人与小鼠的给药剂量换算系数折算成小鼠用量[4]：D组50 g/kg,E组25 g/kg,C组5 mg/kg,各组小鼠均灌胃0.2 mL/d,A组和B组给予等量生理盐水,连续12周。
1.6Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原测定
给药12周后,于取材前夜禁食水,次日处死动物。无菌条件下取出心脏和主动脉,10%中性甲醛固定,脱水,常规石蜡包埋切片。小鼠心底部横断面连续切片,切片厚5 μm。相邻的2个切面分别进行苦味酸-天狼星红染色和免疫组化染色,光镜下观察。苦味酸-天狼星红染色步骤如下：①切片常规脱蜡至水；②0.1%饱和苦味酸-天狼星红溶液染色2 h,流水冲洗10 min；③苏木素mayer复染5 min,取出后流水冲洗10 min；④常规脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。经苦味酸-天狼星红染色后,在20倍偏振光显微镜下,采用IPP6.0图像分析软件测量并计算斑块Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原各自的面积、Ⅲ型胶原/Ⅰ型胶原的比值。
1.7基质金属蛋白酶-9测定
选取苦味酸-天狼星红染色邻近切面,采用Envision免疫组化两步法染色检测主动脉根部动脉粥样斑块内MMP-9的表达,MMP-9一抗稀释度为1∶300,每组均以PBS代替一抗作为阴性对照 ......
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