灭幽汤对幽门螺杆菌相关性胃炎脾胃湿热证小鼠热休克蛋白70和水通道蛋白4的影响(2)
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2.3 观察指标及方法
2.3.1 胃组织病理观察 常规石蜡包埋，切片厚4～5 μm，常规脱蜡水洗；置苏木素染液中浸染2～4 min，水洗；1%盐酸分化约10 s，水洗；于流水中5～10 min，细胞核由淡紫红色变为蓝色时即可；置于伊红染液中浸染30 s；分别置于95%乙醇、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ脱水；再用二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明；中性树胶封片；光镜下观察。
2.3.2 免疫组化法检测水通道蛋白4 石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min。0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲液(pH 6.0)中微波炉加热修复抗原。3%H2O2室温孵育10 min，PBS冲洗5 min×3次。10%正常山羊血清封闭，室温孵育10 min。倾去血清，滴加AQP4的一抗(1∶100)，37 ℃孵育2 h。PBS冲洗，5 min×3次。滴加AQP4二抗(1%BSA-PBS稀释)，37 ℃孵育30 min。PBS冲洗，5 min×3次。滴加辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释)，37 ℃孵育30 min。PBS冲洗，5 min×3次。加入DAB显色剂显色。自来水充分冲洗，复染，封片。使用病理图像分析系统对样本图像进行分析。每个样本随机选取3个高倍视野，计算黄褐色阳性表达的面密度(阳性表达总面积/统计区域总面积)，以此表示AQP4蛋白的表达，进行半定量分析。
2.3.3 Western Blot检测热休克蛋白70 按照BCA蛋白定量试剂盒进行HSP70的免疫组化检测。配制适量BCA工作液，完全溶解蛋白标准品，浓度为2 mg/mL，加用于稀释标准品的溶液到20 μL。各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置30 min。测定波长，计算蛋白浓度。配10%～12%分离胶，加入TEMED，立即摇匀后灌胶并用异丙醇封胶。3 min后倒去胶上层异丙醇并用吸水纸将其吸干。进行电泳并转膜，转膜完毕后，TBST冲洗1次×5 min。检测蛋白转膜的效率，用TBST洗净后，用TBST配制5%脱脂奶粉封闭1 h再与HSP70一抗结合，洗膜后与二抗结合60 min，漂洗。ECL法检测NC膜，进行图像分析。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，因数据符合正态性和方差齐性，进行各组间方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 造模情况
模型组小鼠表现出食少纳呆、少饮、大便溏、肢体困重等脾胃湿热证候。光镜下模型组小鼠胃黏膜多为充血肿胀 ......
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