肝郁脾虚证模型大鼠红细胞和促红细胞生成素变化规律研究(1)
摘要：目的 检测不同时段肝郁脾虚证模型大鼠外周红细胞、骨髓红细胞及造血细胞调节因子，从血液系统探讨其变化规律。方法 采用束缚应激+夹尾激怒+过度疲劳+饮食失节方法建立肝郁脾虚证大鼠模型，检测空白对照组和模型2、6、9周组大鼠外周红细胞、骨髓有核红细胞、干细胞因子及促红细胞生成素。结果 与空白对照组比较，模型2周组大鼠红细胞压积和晚幼红细胞数量升高(P<0.05)，模型6周组大鼠促红细胞生成素降低(P<0.01)，模型9周组大鼠红细胞计数、血红蛋白含量、红细胞压积和促红细胞生成素降低(P<0.05)；与模型2周组比较，模型6、9周组大鼠红细胞计数、血红蛋白含量、红细胞压积、早幼红细胞比例、晚幼红细胞比例和促红细胞生成素降低(P<0.05，P<0.01)，模型9周组有核红细胞比例降低(P<0.05)；干细胞因子差异无统计学意义。结论 肝郁脾虚证大鼠遭受应激刺激时虽然短期能使红细胞的数量增加以对抗伤害因素作用，但长期作用会导致机体贫血，可能与促红细胞生成素减少有关。
关键词：肝郁脾虚证；红细胞；促红细胞生成素；大鼠
, 百拇医药
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.03.020
中图分类号：R228 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2015)03-0077-03
长期以来，研究者对肝郁脾虚证的研究主要针对于自主神经、内分泌等系统功能失调[1]。但中医理论认为，肝主藏血，主疏泄，脾主统血，主运化，为气血生化之源。余霖《疫诊一得》谓：“血生于心，藏于肝，统于脾。”《内经》指出，“肝藏血，主情志，性喜疏泄条达，与气血休戚相关”。表明肝脏调节血液的流行分布，脾的运化功能又依赖于肝的疏泄，而肝藏之血，又赖脾之化生，所以，肝脾相互协调，共同维持血液的生成和循行。由此可见，肝脾两脏对气血津液的调节及血液化生有密切的关系，但系统研究肝郁脾虚证对血液系统的影响尚未见报道。故本研究通过动物实验观察不同时段肝郁脾虚证模型大鼠外周红细胞、骨髓红细胞及造血细胞调节因子的变化情况，从血液系统探讨该模型大鼠的生物学特点。
, http://www.100md.com
1 实验材料
1.1 动物
雄性SPF级Wistar大鼠40只，3月龄，体质量(200±10)g，甘肃中医学院实验动物中心提供，动物合格证号SCXK(甘)2001-0001。
1.2 主要试剂与仪器
促红细胞生成素(EPO)定量酶联检测试剂盒(上海森雄科技有限公司，批号1106094)，干细胞因子(SCF)定量酶联检测试剂盒(上海森雄科技有限公司，批号1109145)。950S动物血球分析仪(HEMAVET，美国)，连续波长酶标仪(BIO-RAD Benchmark Plus，美国)，骨髓细胞分析系统(重庆天海公司)。
2 实验方法
2.1 分组
, http://www.100md.com
按随机数字表法将40只大鼠随机分空白对照组和肝郁脾虚证模型2、6、9周组(模型2、6、9周组)。每组10只。
2.2 肝郁脾虚证大鼠模型的建立
采用束缚应激+夹尾激怒+过度疲劳+饮食失节的复合方法复制肝郁脾虚证动物模型[2-5]。为避免大鼠对此过程产生适应，本实验采用夹尾激怒、过度疲劳与束缚应激、过度疲劳每日交替进行。将造模大鼠每笼分装5只，夹尾激怒时先将同笼中的3只大鼠用长尾夹夹鼠尾远端l/3处，令其暴怒，15 min后再交换夹另外2只大鼠，总刺激时间为30 min，每日上午2次；束缚应激时将大鼠每日上午9：00放置于束缚盒中约束3 h；下午2：00将夹尾激怒或束缚应激后大鼠置于水温(22±1)℃大塑料桶中游泳10 min，造成过度疲劳。采用隔日喂食、饮水不限方法同时进行。
2.3 检测指标
模型组大鼠分别在第2、6、9周股动脉取血和骨髓检测，空白对照组与大鼠模型9周组同步检测。其中1 mL血用含有10%EDTANa2 30 μL的预冷试管收集，混匀，立即检测外周血常规；其余血制备血清，用于细胞因子EPO、SCF检测。快速取大鼠双侧股骨，骨剪纵形剪开左侧股骨，尖头镊取骨髓，以胎牛血清稀释并涂片，瑞氏染色，备做骨髓涂片检测。
, 百拇医药
3 统计学方法
采用SPSS11.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，组间比较采用方差分析。检验标准α=0.05。
4 结果
4.1 各组大鼠外周血红细胞计数、血红蛋白含量和红细胞压积变化
与空白对照组比较，模型2周组大鼠红细胞压积(HCT)升高(P<0.05)，模型9周组大鼠红细胞计数(RBC)、血红蛋白(Hb)含量和HCT降低(P<0.05)；与模型2周组大鼠比较，模型6、9周组大鼠RBC、Hb、HCT降低(P<0.05，P<0.01)。结果见表1。
4.2 各组大鼠骨髓有核红细胞变化
与空白对照组比较，模型2周组大鼠晚幼红细胞计数升高(P<0.05)；与模型2周组比较，模型9周组大鼠有核红细胞比例降低(P<0.05)，模型6、9周组大鼠早幼、晚幼红细胞比例降低(P<0.05，P<0.01)。结果见表2。
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4.3 各组大鼠血清促红细胞生成素、干细胞因子变化
与空白对照组比较，模型6、9周组大鼠EPO降低(P<0.01)；与模型2周组比较，模型6、9周组大鼠EPO降低(P<0.05)；各组SCF比较差异无统计学意义。结果见表3。
5 讨论
本实验外周血红细胞检测与骨髓象红细胞检测结果相一致，较短的2周应激刺激时，机体充分调动血液系统功能，骨髓通过增强其增殖能力来应对恶劣环境改变，尽量生成和释放大量成熟红细胞入血，增强携氧能力，但一定程度上RBC增多与血液高黏和高凝的状态有关。但随着刺激时间延长，6周或9周的慢性刺激下，肝郁脾虚大鼠骨髓已无法再保持旺盛的增殖状态，骨髓细胞中有核红细胞比例减少尤其是晚幼红细胞比例降低，且肝脾功能障碍导致消化吸收能力减弱，骨髓生成RBC减少造成机体贫血。, 百拇医药(岳嘉 刘建鸿 程晓丽 车敏)
关键词：肝郁脾虚证；红细胞；促红细胞生成素；大鼠
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DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.03.020
中图分类号：R228 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2015)03-0077-03
长期以来，研究者对肝郁脾虚证的研究主要针对于自主神经、内分泌等系统功能失调[1]。但中医理论认为，肝主藏血，主疏泄，脾主统血，主运化，为气血生化之源。余霖《疫诊一得》谓：“血生于心，藏于肝，统于脾。”《内经》指出，“肝藏血，主情志，性喜疏泄条达，与气血休戚相关”。表明肝脏调节血液的流行分布，脾的运化功能又依赖于肝的疏泄，而肝藏之血，又赖脾之化生，所以，肝脾相互协调，共同维持血液的生成和循行。由此可见，肝脾两脏对气血津液的调节及血液化生有密切的关系，但系统研究肝郁脾虚证对血液系统的影响尚未见报道。故本研究通过动物实验观察不同时段肝郁脾虚证模型大鼠外周红细胞、骨髓红细胞及造血细胞调节因子的变化情况，从血液系统探讨该模型大鼠的生物学特点。
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1 实验材料
1.1 动物
雄性SPF级Wistar大鼠40只，3月龄，体质量(200±10)g，甘肃中医学院实验动物中心提供，动物合格证号SCXK(甘)2001-0001。
1.2 主要试剂与仪器
促红细胞生成素(EPO)定量酶联检测试剂盒(上海森雄科技有限公司，批号1106094)，干细胞因子(SCF)定量酶联检测试剂盒(上海森雄科技有限公司，批号1109145)。950S动物血球分析仪(HEMAVET，美国)，连续波长酶标仪(BIO-RAD Benchmark Plus，美国)，骨髓细胞分析系统(重庆天海公司)。
2 实验方法
2.1 分组
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按随机数字表法将40只大鼠随机分空白对照组和肝郁脾虚证模型2、6、9周组(模型2、6、9周组)。每组10只。
2.2 肝郁脾虚证大鼠模型的建立
采用束缚应激+夹尾激怒+过度疲劳+饮食失节的复合方法复制肝郁脾虚证动物模型[2-5]。为避免大鼠对此过程产生适应，本实验采用夹尾激怒、过度疲劳与束缚应激、过度疲劳每日交替进行。将造模大鼠每笼分装5只，夹尾激怒时先将同笼中的3只大鼠用长尾夹夹鼠尾远端l/3处，令其暴怒，15 min后再交换夹另外2只大鼠，总刺激时间为30 min，每日上午2次；束缚应激时将大鼠每日上午9：00放置于束缚盒中约束3 h；下午2：00将夹尾激怒或束缚应激后大鼠置于水温(22±1)℃大塑料桶中游泳10 min，造成过度疲劳。采用隔日喂食、饮水不限方法同时进行。
2.3 检测指标
模型组大鼠分别在第2、6、9周股动脉取血和骨髓检测，空白对照组与大鼠模型9周组同步检测。其中1 mL血用含有10%EDTANa2 30 μL的预冷试管收集，混匀，立即检测外周血常规；其余血制备血清，用于细胞因子EPO、SCF检测。快速取大鼠双侧股骨，骨剪纵形剪开左侧股骨，尖头镊取骨髓，以胎牛血清稀释并涂片，瑞氏染色，备做骨髓涂片检测。
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3 统计学方法
采用SPSS11.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，组间比较采用方差分析。检验标准α=0.05。
4 结果
4.1 各组大鼠外周血红细胞计数、血红蛋白含量和红细胞压积变化
与空白对照组比较，模型2周组大鼠红细胞压积(HCT)升高(P<0.05)，模型9周组大鼠红细胞计数(RBC)、血红蛋白(Hb)含量和HCT降低(P<0.05)；与模型2周组大鼠比较，模型6、9周组大鼠RBC、Hb、HCT降低(P<0.05，P<0.01)。结果见表1。
4.2 各组大鼠骨髓有核红细胞变化
与空白对照组比较，模型2周组大鼠晚幼红细胞计数升高(P<0.05)；与模型2周组比较，模型9周组大鼠有核红细胞比例降低(P<0.05)，模型6、9周组大鼠早幼、晚幼红细胞比例降低(P<0.05，P<0.01)。结果见表2。
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4.3 各组大鼠血清促红细胞生成素、干细胞因子变化
与空白对照组比较，模型6、9周组大鼠EPO降低(P<0.01)；与模型2周组比较，模型6、9周组大鼠EPO降低(P<0.05)；各组SCF比较差异无统计学意义。结果见表3。
5 讨论
本实验外周血红细胞检测与骨髓象红细胞检测结果相一致，较短的2周应激刺激时，机体充分调动血液系统功能，骨髓通过增强其增殖能力来应对恶劣环境改变，尽量生成和释放大量成熟红细胞入血，增强携氧能力，但一定程度上RBC增多与血液高黏和高凝的状态有关。但随着刺激时间延长，6周或9周的慢性刺激下，肝郁脾虚大鼠骨髓已无法再保持旺盛的增殖状态，骨髓细胞中有核红细胞比例减少尤其是晚幼红细胞比例降低，且肝脾功能障碍导致消化吸收能力减弱，骨髓生成RBC减少造成机体贫血。, 百拇医药(岳嘉 刘建鸿 程晓丽 车敏)