2.2 组方制备

    将组方(山楂、当归、山萸肉等)饮片分别粉碎成粗粉(40目)，分别称取适量粉末于具塞三角瓶中，加入适量乙醇，混匀，浸泡0.5 h，超声提取(功率500 W，频率40 kHz)1 h，提取2次，分别过滤，减压回收乙醇，制得浓度为250 g/L的药液，备用。

    2.3 酪氨酸酶活性测定

    参考文献[6]方法，采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法检测酪氨酸酶活性，反应混合物与体积见表3，计算酪氨酸酶抑制率。酪氨酸酶抑制率(%)=

    [(A475a-A475b)-(A475c-A475d)]/(A475a-A475b)×100%。式中，a为未加中药的加酶混合液，b为未加中药和酶的混合液，c为加中药和酶的混合液，d为加中药而未加酶的混合液。

    2.4 多巴色素自动氧化生成黑素量测定

    将酪氨酸酶试液(135 U/mL)0.5 mL在25 ℃温育10 min，加入多巴溶液(0.03%)0.5 mL，一起温育5 min，然后分别加入PBS溶解的受试物0.5 mL(500、200、50 μg/mL)并温育60 min，加入1 mol/L盐酸2 mL终止反应，将该混合物于3000 r/min离心15 min，沉淀物分别用6 mol/L盐酸1 mL洗1次、双蒸水洗2次，然后用1 mol/L NaOH溶液2 mL充分溶解离心团块，用分光光度计在400 nm处测定吸光度(OD值)。以黑素量为横坐标，OD值为纵坐标，进行线性回归，得回归方程Y=5.1X+0.47(r=0.999 9)。结果表明黑素量在0～160 μg/mL范围内OD值与黑素量呈良好的线性关系 ......