1.9 RT-PCR检测结肠水通道蛋白8 mRNA表达

    采用Trizol法提取结肠总RNA，超微量分光光度计测定260 nm和280 nm吸光度，计算OD260/OD280和OD260/OD230，分析RNA的浓度和纯度。严格按照Fast Quant cDNA第一链合成试剂盒和GoTaq? qPCR Master Mix(A6001)试剂盒说明书，去除gDNA并合成cDNA，用RT-PCR仪进行扩增。PCR扩增反应条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃复性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循环40次。用2-ΔΔCt法进行分析，以GAPDH为内参，计算AQP8 mRNA的相对表达量。GAPDH引物序列：上游5'-CGTGCCT GGAGAAACCTG-3'，下游5-AGAGTGGGAGTTGA AGTCC-3'，扩增长度242 bp。AQP8引物序列：上游5'-TGGCTGGCCTCTTTGTAGGA-3'，下游5'-GCTGT CATGGTGACTCCTGTT-3'，扩增产物长度200 bp。

    1.10 Western blot测定结肠水通道蛋白8蛋白表达

    用组织裂解液和PMSF提取结肠总蛋白，BCA法制备蛋白标准曲线，检测各样本蛋白浓度。以总蛋白∶上样缓冲液=3∶1稀释并变性。制备15%聚丙烯酰胺凝胶，电泳分离并转膜至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭 ......