相思子毒素双抗夹心ELISA检测方法的建立与评价(1)
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【摘要】 目的 建立相思子毒素双抗夹心ELISA检测方法并进行方法学评价。方法 优化最佳相思子毒素多抗包被浓度后建立了相思子毒素双抗夹心ELISA检测方法,鉴定其检测灵敏度、线性范围、特异性、重复性、回收率等。结果 双抗夹心ELISA方法检测相思子毒素的最小检出限为1 ng/mL,标准曲线在10～100 ng/mL范围内线性良好。血清中加入已知量的标准毒素蛋白,测得平均回收率为89%。结论 本方法检测相思子毒素的可测范围广、特异性强、灵敏度高、变异系数较小,表明其灵敏、特异、可靠。
【关键词】 相思子毒素;双抗体夹心ELISA;方法学评价
【Abstract】 Objective To establish a double antibody sandwich ELISA method for detection of abrin and analyze the methodology.Methods After the optimal coating concentration of polyclonal antibody of abrin was optimized;a double antibody sandwich ELISA method was established.Detection sensitivity,linear range,specificity,repeatability and recovery rate were assayed.Results The minimal detection limit of abrin was 1 ng/mL and the linearity of standard curve was fine in the range of 10 to 100 ng/mL.The average recovery was 89% when the known amounts of standard toxin protein was added into blood samples.Conclusion This method for detection of abrin is sensitive,specific and reliable because of its wide measure range,high sensitivity,good specificity,small coefficient of variability.
【Key words】 Abrin;Double antibody sandwich ELISA;Methodological evaluation
相思子毒素(abrin)是存在于豆科植物相思子(Abrus precatorius)种子中的一种毒蛋白,与蓖麻毒素(ricin)同为Ⅱ型核糖体失活蛋白(RIP)家族成员,是迄今为止所发现的毒性最强的植物毒素之一,毒性是普通化学武器的几百倍。相思子毒素已经成为一个成功的天然毒素战剂[1-2]。
由于相思子毒素天然资源比较丰富,制备比较容易,并且相思子毒素中毒后无特异症状,出现症状时已经造成机体严重的器质损害,具备生物毒素武器典型特征,因此历来为外军所高度重视[3]。在2001年世界生物及毒素武器大会(BTWC)上,相思子毒素再次被列入重点核查清单。因此,无论是从核查、应用治疗,还是从防护目的,开展对相思子毒素的研究具有十分重要的意义[4-5]。
本研究利用相思子毒素的多抗和单抗建立相思子毒素的双抗夹心ELISA检测方法,并对检测方法进行了方法学评价。本方法对建立相思子毒素检测试剂盒具有重要的现实意义与应用价值。
1材料与方法
1.1材料相思子毒素、相思子毒素单抗和多抗由本实验室保存,HRP标记的羊抗鼠抗体购自北京华美公司。
1.2检测过程①样品稀释:将相思子毒素进行如下稀释,1 μg/mL、100 ng/mL、10 ng/mL、1 ng/mL、100 pg/mL、10 pg/mL、0 g/mL。②包被:加入包被液稀释的相思子毒素多抗(1∶1 000稀释),100 μL/孔,4 ℃过夜。甩干包被液,PBST缓冲液洗涤液洗涤3次,3 min/次。③封闭:加入1%BSA封闭液,100 μL/孔,37 ℃ 60 min,甩干;PBST洗涤液洗涤3次,3 min/次。④加样:加入相思子毒素蛋白,100 μL/孔,每个样品重复3个孔,同时设阳性对照、阴性样品和空白对照,37 ℃ 60 min甩干液体,洗涤液洗涤3次,3 min/次。⑤加相思子毒素单抗(1∶4 000稀释):100 μL/孔。37 ℃ 60 min甩干液体,洗涤液洗涤3次,3 min/次。⑥每孔加入100 μL辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体(1∶5 000),37 ℃恒温0.5 h,洗板3次(同前),每孔加入100 μL底物溶液显色15 min,加入2.0 mol/L H2SO4 100 μL 终止反应,于酶标仪上读取450 nm吸收波长处的OD值。⑦结果判断:以P(待测样本OD值)/(阴性样本OD值)大于2.1判为阳性。
2结果
2.1相思子毒素多抗包被浓度的确定包被不同浓度相思子毒素多抗的酶标板,在相同条件下进行间接ELISA实验,结果(图1)。当相思子毒素多抗的包被浓度在1.0～50.0 μg/mL范围时,OD450值呈上升趋势;浓度高于50.0 μg/mL时OD450值趋于饱和,故相思子毒素多抗的最佳包被浓度为50.0 μg/mL。
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