董萍 彭海英 高璐 赵洪礼

    重组Apoptin的叶酸修饰及诱导肿瘤细胞凋亡活性研究

    董萍 彭海英 高璐 赵洪礼

    为了使重组GST-Apoptin融合蛋白能够与肿瘤细胞靶向性结合，并发挥其特异性诱导肿瘤细胞凋亡的作用，本文采用化学方法将叶酸连接到GST-Apoptin融合蛋白，实验结果表明叶酸与GST-Apoptin融合蛋白的偶联率为6%，最佳偶联条件是20 mg/mL活化叶酸在pH 10.0条件下室温反应60 min。叶酸化的GST-Apoptin融合蛋白(folate-GST-Apoptin)具有显著诱导肿瘤细胞凋亡作用，1.0 μg/mL的folate-GST-Apoptin可使50%的肿瘤细胞(KG-1)凋亡，而对正常人外周血淋巴细胞没有诱导凋亡作用。

    凋亡；叶酸；Apoptin

    来源于鸡贫血病毒的鸡贫血病毒蛋白-3(vp3)对人的各种肿瘤细胞和异常转化细胞具有特异性杀伤作用。由于vp3能够选择性地诱导肿瘤细胞和转化细胞的凋亡，而不诱导正常细胞的凋亡，被命名为肿瘤特异性凋亡因子(Apoptin)[1-3]。研究结果表明，Apoptin诱导肿瘤细胞凋亡不依赖于抑癌基因-53(p53)作用途径，也不被抑制细胞凋亡基因(Bcl-2)过量表达所抑制，因此有希望成为有效治疗癌症的新型生物制剂[4-5]。由于人肿瘤细胞表面没有鸡贫血病毒蛋白受体，故Apoptin蛋白不可能与人的肿瘤细胞结合而诱导肿瘤细胞凋亡，实验结果亦证明了这一点。为解决这一问题，本研究建立了重组GST-Apoptin融合蛋白叶酸修饰方法，以激活GST-Apoptin诱导肿瘤细胞凋亡的活性，使GST-Apoptin融合蛋白能够与肿瘤细胞发生靶向结合，并诱导肿瘤细胞凋亡，以达到能够满足临床治疗肿瘤的目的。

    1 材料和方法

    1.1 仪器设备 Unic 2101型紫外可见分光光度计(上海Unic公司)、Startorious 1721型电子天平(德国)、85-2型恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器厂)、SHZ-88-1型台式水浴恒温振荡器(江苏太仓鹿河生化仪器厂)。

    1.2 细胞与试剂 人KG1细胞株购于中国科学院上海细胞所，常规传代培养KG1细胞；叶酸(Sigma产品)，GST-Apoptin本实验室表达纯化，其他所用化学试剂均为国产，分析纯。

    1.3 GST-Apoptin融合蛋白的化学化修饰

    1.3.1 GST-Apoptin融合蛋白预处理 取纯化的GST-Apoptin融合蛋白溶解(1.5 mg/mL)10 mL ......