环境内分泌干扰物与儿童性早熟发病的关系(2)
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KEY WORDS environmental endocrine disruptors； precocious puberty； high performance liquid chromatography
儿童性发育异常，特别是性早熟的发病率近年来显著增高，已成为最常见的小儿内分泌疾病之一。流行病学调查研究发现，上海地区目前儿童性早熟患病率大约为1 000/10万，男女比例为1 ： 5[1]。近年来国外有大量文献报告显示，洗涤剂、农药及塑料工业等向环境排放的物质及其分解产物，可以在自然界产生一系列的环境内分泌干扰物(Environmental endocrine disruptors，EEDs)。当EEDs进入机体后，可以干扰内分泌激素的合成、释放、转运、与受体结合、代谢等途径，从而影响内分泌系统的功能，破坏机体内环境的协调和稳定。这些物质大多具有拟雌激素活性，如果进入儿童体内，与靶器官上的雌激素受体结合，将引致生殖器官及骨骼的提早发育，有可能成为性早熟的致病因素之一[2]。我们曾检测出性早熟患儿及正常儿童血清中的3种有代表性的EEDs：洗涤剂降解产物—壬基酚(4-NP)、有机氯农药DDT的代谢产物(P，P’-DDE)和塑料增塑剂—邻苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)的含量，发现当前的正常儿童已较普遍地暴露于EEDs，特别是受到当年大量施放的有机氯农药DDT所造成的残毒影响更为明显，而性早熟患儿暴露于EEDs的程度则还要严重得多[3]。鉴于我们的生存环境中常见的EEDs多达数十种，本文选择了另几种有代表性的EEDs：洗涤剂降解产物—辛基酚(OP)、合成树脂原料—双酚A (BPA)和塑料增塑剂—邻苯二甲酸二丁酯(DBP)，检测其在性早熟患儿及正常儿童血清中的含量，并同时测定性早熟患儿靶器官的发育指标，包括子宫、卵巢体积及血清雌二醇(E2)水平，通过患儿血清中EEDs的含量与上述指标间的相关性分析，进一步探讨EEDs暴露与性早熟发病之间的关系。
1 对象与方法
1.1 研究对象
1.1.1 纳入标准
收集2005年3月至2005年9月在复旦大学附属儿科医院性早熟专科门诊就诊的初诊患儿，性早熟的诊断标准按《性早熟及青春期延迟》[1]。共收集性早熟女孩110例，起病年龄为6.0～8.3岁，初诊年龄6.1～11.3岁。
1.1.2 排除标准
凡由中枢神经系统、内分泌系统和生殖系统器质性病变所致的性早熟均被排除在外。
1.1.3 对照组
选取年龄与性早熟组相匹配的正常女孩作为对照，共100例，年龄6.5～11.2岁。
1.2 实验方法
1.2.1 OP、BPA高效液相色谱检测
1)样品采集及预处理 每例采集血清2 ml，-80℃冻存待测。
(1) OP的样品预处理 取1 ml血清，加入5 ml正己烷，旋涡混匀5 min，取出上层有机层正己烷，50℃水浴中用空气吹干，用甲醇饱和的正已烷定容至0.1 ml后取上清液20 μL进样。
(2)BPA的样品预处理 取0.5 ml血清，加入100 ?l的0.01 mol/L磷酸缓冲液，20 ?l β-葡萄糖酸酐酶，37℃水浴3 h，冷却后先后用3 ml及2 ml乙醚-正己烷(1∶1)涡旋混匀后各2 min进行萃取，合并两次萃取的有机层，置于40 ℃水浴中用氮气吹干，50 ?l 40%的乙腈溶解后进样。
(3)避免污染 为避免洗涤剂污染，实验用玻璃器皿均用重铬酸钾浓硫酸溶液浸泡过夜，清洗烘干，使用前再用正己烷或乙醇淋洗两次。
2)高效液相色谱分析 采用HP1100高效液相色谱仪检测
(1)OP的色谱条件 采用Inertsil ODS-3 4.6 mm×250 mm，5 ?m色谱柱(日本GL公司)；荧光检测器(激发波长为275 nm，发射波长为312 nm)柱温为40 ℃，流动相为甲醇∶水∶三氟乙酸(1000∶50∶1)，流速为1 ml/min，进样为20 ?l。
(2)BPA的色谱条件 Inertsil ODS-3 4.6 mm×250 mm，5 μm色谱柱(日本GL公司)；流动相为乙晴∶水∶四氢呋喃(40∶60∶3)；检测波长：激发波长为227 nm，发射波长为310 nm；流速为1 ml/min；柱温为40 ℃。整个色谱时间为25 min，进样为20 ?l。
(3)定性分析 用OP，BPA标样测定其保留时间，样品的定性分析采用与标样的保留时间相对照的方法进行。
(4)定量分析 样品处理后进行色谱分析 ......
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