碳酸酐酶Ⅱ基因克隆及在毕赤酵母中的异源表达(2)
 |
2 方法
2.1 caⅡ基因的克隆、表达质粒构建及电转化至毕赤酵母GS115
以人胎盘组织提取的总RNA进行反转录，按反转录试剂盒说明书的方法合成cDNA；设计引物5’-Primer：(GACCCAAT)CTCGAGGCAGTGGTCAAAGTGCCCCTG(下划线为Xho I 位点)，3’-Primer：(GT)GCGGCCGCTTA GGCGGCAGTGGCAAAGC(下划线为Not I位点)，再以cDNA为模板通过PCR扩增获编码CA Ⅱ的基因片段(PCR条件： 95 ℃，5 min； 94 ℃变性30 s； 54 ℃退火30 s； 72 ℃延伸40 s；循环32 次； 最终70 ℃ 10 min，于16℃保存)，扩增的caⅡ基因片段经Xho I和Not I双酶切克隆至P. pastoris的分泌型表达载体pPIC9k，获得表达质粒pPIC9k-CAⅡ(图1) ......
您现在查看是摘要页，全文长 3553 字符。