脑蛋白水解物片剂肽含量测定方法的改进(1)
摘 要 目的：优化脑蛋白水解物片中肽含量测定方法。方法：采用分子排阻色谱法鉴别脑蛋白水解物片中小分子肽类、高效液相色谱法测定脑蛋白水解物片中肽含量。结果：分子排阻色谱法鉴别小分子肽特异性强；高效液相色谱法测定的各种氨基酸在一定的浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系(r>0.999)，平均回收率为98.0%～102.4%。结论：该方法快速、简便、专属性强、重复性好， 结果准确可靠， 适用于脑蛋白水解物片的质量控制。
关键词 脑蛋白水解物片 质量控制 肽 分子排阻色谱 高效液相色谱
中图分类号：R282.74； R927.2； O657.72 文献标识码：A 文章编号：1006-1533(2016)03-0076-05
Optimization of a method for the determination of peptide content in cerebroprotein hydrolysate tablets
TANG Xiaoshu*， LU Zhiying， FAN Qijun
(Shanghai Greatwall Pharmaceutical Co. Ltd.， Shanghai 201206， China)
ABSTRACT Objective： To optimize a method for the determination of peptide content in cerebroprotein hydrolysate tablets. Methods： A size-exclusion chromatography method and an HPLC method were used for the identification of peptide and the determination of peptide content in cerebroprotein hydrolysate tablets， respectively. Results： The result of size-exclusion chromatography method had the advantages of high specificity. The standard curve of every amino acid was linear (r>0.999)with average recovery 98.0%～102.4%. Conclusion： This method is simple， accurate， sensitive and reproducible， and can be applied in the quality control of cerebroprotein hydrolysate tablets.
KEY WORDS cerebroprotein hydrolysate tablets； quality control ； peptide； size-exclusion chromatography； HPLC
脑蛋白水解物为从健康猪新鲜大脑组织中提取的一种活性肽类水解物，其作为一种大脑所特有的肽能神经营养物质，通过作用于中枢神经，调节和改善神经元的代谢，促进突触的形成，诱导神经元的分化，并进一步保护神经细胞免受各种缺血和神经毒素的损害[1-2]。脑蛋白水解物片在临床上广泛用于改善失眠、头痛、记忆力下降、头晕及烦躁等症状，可促进脑外伤后遗症、脑血管疾病后遗症、脑炎后遗症、急性脑梗塞和急性脑外伤的康复。药理实验结果显示，脑蛋白水解物主要药效成分为小分子肽，以上肽类能通过血脑屏障，促进脑内蛋白质的合成，影响呼吸链，具有抗缺氧的保护能力，改善脑内能量代谢，激活腺苷酸环化酶和催化其它激素系统，并提供神经递质、肽类激素及辅酶前体[3-4]。
脑蛋白水解物片现行的质量标准规定药品规格为6.5 mg(按氨基氮计算)或14.4 mg(按总氮计算)[5]。在该项国家标准中，只有2项显色反应作为鉴别反应，并只采用滴定法对产品的总氮、氨基氮含量进行控制，方法落后，专属性与有效性都较差。缺乏对脑蛋白水解物片中主要药效成分小分子肽质量控制的科学方法及指标。
本研究参考文献提高了脑蛋白水解物片质量标准，通过分子排阻色谱法对小分子肽进行鉴别[6-7]，并采用Waters AccQ-Tag衍生法来测定脑蛋白水解物片肽含量[8-10]，制订出针对主要药效成分小分子肽合理的质量控制指标。提高了脑蛋白水解物片质量可控性，使制剂各组分达到有效剂量范围，从而保证疗效。
1 材料与方法
1.1 仪器与试药
Agilent 1100液相色谱仪，DAD检测器、自动进样器(安捷伦科技中国有限公司)。Waters 2695/2487液相色谱仪，VWD检测器、自动进样器(美国Waters公司)。Sartorius BP121S电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)。Sartorius BP121S电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)。
脑蛋白水解物对照品溶液(批号：140697-200602)、16种氨基酸对照品(批号：624-200104)和D-正亮氨酸对照品(批号：140687-200401)均购自中国药品生物制品检定所。脑蛋白水解物片(批号：20131001)为本公司产品。Waters AccQ-Fluor试剂盒(美国Waters公司，氨基酸衍生用)。乙腈和异丙醇为色谱纯，水为超纯水，磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、乙酸钠、磷酸均为分析纯。
1.2 色谱条件
1.2.1 分子排阻色谱
采用Agilent 1100液相色谱仪和TSK GEL 2000 SWxl 型凝胶色谱柱(7.8 mm×300 mm，5 μm)，流动相：磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钾10.63 g与磷酸二氢钾5.31 g，加异丙醇50 ml，加水至约800 ml，用磷酸调节pH至7.0，加水稀释至1000 ml)。柱温：30 ℃。检测波长：280 nm。流速：0.6 ml/min，进样量10 μl。, 百拇医药(汤晓枢 陆志英 樊琪俊)
关键词 脑蛋白水解物片 质量控制 肽 分子排阻色谱 高效液相色谱
中图分类号：R282.74； R927.2； O657.72 文献标识码：A 文章编号：1006-1533(2016)03-0076-05
Optimization of a method for the determination of peptide content in cerebroprotein hydrolysate tablets
TANG Xiaoshu*， LU Zhiying， FAN Qijun
(Shanghai Greatwall Pharmaceutical Co. Ltd.， Shanghai 201206， China)
ABSTRACT Objective： To optimize a method for the determination of peptide content in cerebroprotein hydrolysate tablets. Methods： A size-exclusion chromatography method and an HPLC method were used for the identification of peptide and the determination of peptide content in cerebroprotein hydrolysate tablets， respectively. Results： The result of size-exclusion chromatography method had the advantages of high specificity. The standard curve of every amino acid was linear (r>0.999)with average recovery 98.0%～102.4%. Conclusion： This method is simple， accurate， sensitive and reproducible， and can be applied in the quality control of cerebroprotein hydrolysate tablets.
KEY WORDS cerebroprotein hydrolysate tablets； quality control ； peptide； size-exclusion chromatography； HPLC
脑蛋白水解物为从健康猪新鲜大脑组织中提取的一种活性肽类水解物，其作为一种大脑所特有的肽能神经营养物质，通过作用于中枢神经，调节和改善神经元的代谢，促进突触的形成，诱导神经元的分化，并进一步保护神经细胞免受各种缺血和神经毒素的损害[1-2]。脑蛋白水解物片在临床上广泛用于改善失眠、头痛、记忆力下降、头晕及烦躁等症状，可促进脑外伤后遗症、脑血管疾病后遗症、脑炎后遗症、急性脑梗塞和急性脑外伤的康复。药理实验结果显示，脑蛋白水解物主要药效成分为小分子肽，以上肽类能通过血脑屏障，促进脑内蛋白质的合成，影响呼吸链，具有抗缺氧的保护能力，改善脑内能量代谢，激活腺苷酸环化酶和催化其它激素系统，并提供神经递质、肽类激素及辅酶前体[3-4]。
脑蛋白水解物片现行的质量标准规定药品规格为6.5 mg(按氨基氮计算)或14.4 mg(按总氮计算)[5]。在该项国家标准中，只有2项显色反应作为鉴别反应，并只采用滴定法对产品的总氮、氨基氮含量进行控制，方法落后，专属性与有效性都较差。缺乏对脑蛋白水解物片中主要药效成分小分子肽质量控制的科学方法及指标。
本研究参考文献提高了脑蛋白水解物片质量标准，通过分子排阻色谱法对小分子肽进行鉴别[6-7]，并采用Waters AccQ-Tag衍生法来测定脑蛋白水解物片肽含量[8-10]，制订出针对主要药效成分小分子肽合理的质量控制指标。提高了脑蛋白水解物片质量可控性，使制剂各组分达到有效剂量范围，从而保证疗效。
1 材料与方法
1.1 仪器与试药
Agilent 1100液相色谱仪，DAD检测器、自动进样器(安捷伦科技中国有限公司)。Waters 2695/2487液相色谱仪，VWD检测器、自动进样器(美国Waters公司)。Sartorius BP121S电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)。Sartorius BP121S电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)。
脑蛋白水解物对照品溶液(批号：140697-200602)、16种氨基酸对照品(批号：624-200104)和D-正亮氨酸对照品(批号：140687-200401)均购自中国药品生物制品检定所。脑蛋白水解物片(批号：20131001)为本公司产品。Waters AccQ-Fluor试剂盒(美国Waters公司，氨基酸衍生用)。乙腈和异丙醇为色谱纯，水为超纯水，磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、乙酸钠、磷酸均为分析纯。
1.2 色谱条件
1.2.1 分子排阻色谱
采用Agilent 1100液相色谱仪和TSK GEL 2000 SWxl 型凝胶色谱柱(7.8 mm×300 mm，5 μm)，流动相：磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钾10.63 g与磷酸二氢钾5.31 g，加异丙醇50 ml，加水至约800 ml，用磷酸调节pH至7.0，加水稀释至1000 ml)。柱温：30 ℃。检测波长：280 nm。流速：0.6 ml/min，进样量10 μl。, 百拇医药(汤晓枢 陆志英 樊琪俊)