HPLC法测定注射用肌苷的含量
【摘要】目的：用高效液相色谱法测定注射用肌苷的含量。方法：采用Kromasil C18柱(5μm 4.6mm×250mm)，以甲醇-水(10∶90)作流动相，在248nm紫外波长检测。结果：肌苷在4.23～63.48μg/ml范围内有良好的线性关系(r=0.9999)。低、中、高3个浓度的平均回收率(n=2)分别为101.4%、101.8%、101.1%，RSD为0.46%。结论：该法简便、快速、准确，可作为测定注射用肌苷中肌苷的含量。
【关键词】注射用肌苷；高效液相色谱法；含量测定
【Abstract】ObjectiveA high-performance liquid chromatography (HPLC) was established for the determination of inosine contents in injection.MethodsImpurity in the inosine injection could be separated on Kromasil C18 colnmn (5μm 4.6mm×250mm) using methanol-water (10:90) as mobile phase and UV detector at 248nm.ResultsThe linear range was 4.23～63.48μg/ml(r=0.9999).Average recovery in the lower,moderate and higher inosine concentration groups was respectively 101.4%,101.8% and 101.1%(n=2) with RSD of 0.46%.ConclusionThe method is simple,rapid and accurate.
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【Key words】Inosine injection;HPLC;Concentration determination
【中图分类号】R927.2 【文献标识码】B 【文章编号】1006-1959(2009)06-0244-01
肌苷为微生物发酵制得的辅酶类药物，有改善机体代谢作用，临床用于各种类型的肝脏疾患、心脏疾患、白细胞和血小板减少症、中心视网膜炎及视神经萎缩等。有关标准规定[1]，注射用肌苷含量测定采用紫外分光光度法，该方法操作复杂、费时且专属性差。为了有效地分离降解产物，准确测定注射用肌苷含量，本文采用高效液相色谱法(HPLC)测定注射用肌苷中肌苷含量，获得满意结果。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪：DIONEX P680 HPLC PUMP泵；DIONEX UVD170U紫外检测仪；Chromeleon Server Monitor工作站。肌苷对照品(含量99.2%，中国药品生物制品检定所)，注射用肌苷分别为山西(规格：0.3g批号20060101；2006126)；海南(规格：0.2g批号20051201)。甲醇为色谱纯，试验用水为重蒸馏水。
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2 色谱条件
色谱柱：Kromasil C18(5μm 4.6mm×250mm);流动相：甲醇-水(10：90)；检测波长为248nm；流速1.0ml/min；柱温为25℃；进样量20μl。
3 线性关系的考察
3.1 对照品储备液的制备：精密称取对照品10.58mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。
3.2 标准曲线的绘制：精密吸取对照品储备液1.0、2.0、3.0、5.0、10.0、15.0ml，分别置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，分别进样20μl，依法测定。以各溶液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制工作标准曲线，肌苷的线性回归方程为Y=0.726X+0.068(r=0.9999,n=6),在4.23～63.48μg/ml浓度范围内呈现良好的线性关系。
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4 精密度试验
取含量测定项下肌苷对照品溶液20μl注入液相色谱仪，重复进样5次，测定峰面积，结果肌苷峰面积的RSD为0.14%(n=5)，表明本法精密度良好。
5 重复性试验
按供试品溶液制备方法处理同一批号样品5份，测得肌苷的平均含量为105.5%，RSD为1.3%(n=5)，表明本法重复性良好。
6 回收率试验
精密称取已知含量的样品适量(约相当于肌苷50mg)，分别精密加入肌苷对照品约40mg、50mg、60mg,置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取2ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。按样品含量测定相下方法测定并计算回收率。低、中、高3个浓度的平均回收率(n=2)分别为101.4%、101.8%、101.1%，RSD为0.46%。
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7 稳定性试验
取含量测定项下肌苷对照品溶液20μl分别于0、2、4、6、8、12、24h测定，测得肌苷HPLC峰面积为0.9%，表明溶液在24h内稳定。
8 样品测定
8.1 对照品的制备：取“3.1”项下对照品储备液5ml置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。
8.2 供试品的制备：取装量差异项下的内容物，混合均匀，精密称取适量(约相当于肌苷0.1g)，置100ml量瓶中，加水约70ml，充分振摇使肌苷溶解，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取2ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。
8.3 含量测定：精密量取“8.2”项下供试品溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，同法测定对照品溶液，按外标法以峰面积计算其含量。
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9 讨论
9.1 检测波长的选择：由于肌苷在酸性和高温条件下易分解为次黄嘌呤，且次黄嘌呤在249nm的波长处有最大吸收，肌苷的最大吸收波长为248nm[2]，故选择248nm作为检测波长。
9.2 流动相的选择：经过实验，选择了甲醇-水(10∶90)为流动相，能将杂质(降解产物)与肌苷分离，且分离效果较好，保留时间合适[3]。
参考文献
[1]国家食品药品监督管理局.标准(试行)YBH12992004
[2] 李金屏.肌苷及制剂质量标准修订起草说明.2005年版药典增修订情况介绍
[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典二部[M].北京：化学工业出版社，2005：205
作者单位：455000 河南省安阳市药品检验所, http://www.100md.com(石保龙)
【关键词】注射用肌苷；高效液相色谱法；含量测定
【Abstract】ObjectiveA high-performance liquid chromatography (HPLC) was established for the determination of inosine contents in injection.MethodsImpurity in the inosine injection could be separated on Kromasil C18 colnmn (5μm 4.6mm×250mm) using methanol-water (10:90) as mobile phase and UV detector at 248nm.ResultsThe linear range was 4.23～63.48μg/ml(r=0.9999).Average recovery in the lower,moderate and higher inosine concentration groups was respectively 101.4%,101.8% and 101.1%(n=2) with RSD of 0.46%.ConclusionThe method is simple,rapid and accurate.
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【Key words】Inosine injection;HPLC;Concentration determination
【中图分类号】R927.2 【文献标识码】B 【文章编号】1006-1959(2009)06-0244-01
肌苷为微生物发酵制得的辅酶类药物，有改善机体代谢作用，临床用于各种类型的肝脏疾患、心脏疾患、白细胞和血小板减少症、中心视网膜炎及视神经萎缩等。有关标准规定[1]，注射用肌苷含量测定采用紫外分光光度法，该方法操作复杂、费时且专属性差。为了有效地分离降解产物，准确测定注射用肌苷含量，本文采用高效液相色谱法(HPLC)测定注射用肌苷中肌苷含量，获得满意结果。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪：DIONEX P680 HPLC PUMP泵；DIONEX UVD170U紫外检测仪；Chromeleon Server Monitor工作站。肌苷对照品(含量99.2%，中国药品生物制品检定所)，注射用肌苷分别为山西(规格：0.3g批号20060101；2006126)；海南(规格：0.2g批号20051201)。甲醇为色谱纯，试验用水为重蒸馏水。
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2 色谱条件
色谱柱：Kromasil C18(5μm 4.6mm×250mm);流动相：甲醇-水(10：90)；检测波长为248nm；流速1.0ml/min；柱温为25℃；进样量20μl。
3 线性关系的考察
3.1 对照品储备液的制备：精密称取对照品10.58mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。
3.2 标准曲线的绘制：精密吸取对照品储备液1.0、2.0、3.0、5.0、10.0、15.0ml，分别置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，分别进样20μl，依法测定。以各溶液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制工作标准曲线，肌苷的线性回归方程为Y=0.726X+0.068(r=0.9999,n=6),在4.23～63.48μg/ml浓度范围内呈现良好的线性关系。
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4 精密度试验
取含量测定项下肌苷对照品溶液20μl注入液相色谱仪，重复进样5次，测定峰面积，结果肌苷峰面积的RSD为0.14%(n=5)，表明本法精密度良好。
5 重复性试验
按供试品溶液制备方法处理同一批号样品5份，测得肌苷的平均含量为105.5%，RSD为1.3%(n=5)，表明本法重复性良好。
6 回收率试验
精密称取已知含量的样品适量(约相当于肌苷50mg)，分别精密加入肌苷对照品约40mg、50mg、60mg,置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取2ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。按样品含量测定相下方法测定并计算回收率。低、中、高3个浓度的平均回收率(n=2)分别为101.4%、101.8%、101.1%，RSD为0.46%。
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7 稳定性试验
取含量测定项下肌苷对照品溶液20μl分别于0、2、4、6、8、12、24h测定，测得肌苷HPLC峰面积为0.9%，表明溶液在24h内稳定。
8 样品测定
8.1 对照品的制备：取“3.1”项下对照品储备液5ml置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。
8.2 供试品的制备：取装量差异项下的内容物，混合均匀，精密称取适量(约相当于肌苷0.1g)，置100ml量瓶中，加水约70ml，充分振摇使肌苷溶解，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取2ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。
8.3 含量测定：精密量取“8.2”项下供试品溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，同法测定对照品溶液，按外标法以峰面积计算其含量。
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9 讨论
9.1 检测波长的选择：由于肌苷在酸性和高温条件下易分解为次黄嘌呤，且次黄嘌呤在249nm的波长处有最大吸收，肌苷的最大吸收波长为248nm[2]，故选择248nm作为检测波长。
9.2 流动相的选择：经过实验，选择了甲醇-水(10∶90)为流动相，能将杂质(降解产物)与肌苷分离，且分离效果较好，保留时间合适[3]。
参考文献
[1]国家食品药品监督管理局.标准(试行)YBH12992004
[2] 李金屏.肌苷及制剂质量标准修订起草说明.2005年版药典增修订情况介绍
[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典二部[M].北京：化学工业出版社，2005：205
作者单位：455000 河南省安阳市药品检验所, http://www.100md.com(石保龙)