AGEs对人肾小管上皮细胞Fractalkine mRNA表达的影响
[摘要] 目的:用体外培养的肾小管上皮细胞(TEC),观察糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)诱导下fractalkine (FKN,CX3CL1)mRNA的表达。方法:运用体外制备的糖基化修饰的牛血清白蛋白(AGE-bovine serum albumin,AGE-BSA),按不同的浓度和时间干预TEC,以无血清培养基(DMEM)和不含葡萄糖BSA组(浓度为200 mg/L)为对照,用RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)检测FKN mRNA的表达。结果:TEC的FKN mRNA表达水平随着AGE-BSA浓度增加和干预时间延长而增加(P<0.05),①随着AGE-BSA浓度(50、100、200、400 mg/L)的增高,细胞的FKN mRNA水平随之增高,100 mg/L以上各浓度组FKN mRNA显著高于对照组(P<0.05);②随着干预时间(0、12、24、48)的延长,细胞FKN mRNA表达随之升高,各时间点AGE-BSA组FKN mRNA显著高于对应BSA组(P<0.05)。结论:AGE-BSA可呈剂量及时间依赖性地增加TEC FKN的mRNA表达,提示AGEs可能部分通过FKN途径参与糖尿病肾小管病变的发生发展。
[关键词]糖基化终产物;fractalkine;糖尿病肾病
[中图分类号]R587.2
[文献标识码]B
[文章编号]1006-1959(2009)11-0015-02
糖尿病肾病(DN)是糖尿病严重的微血管并发症之一,是导致终末期肾脏疾病最常见的原因。近期研究证实,糖尿病肾损伤不仅是肾小球的硬化,同时也发生在肾小管。许多研究显示糖基化终末产物(AGEs)形成与堆积是DN的主要发病机制之一[1]。近年来发现,细胞因子尤其趋化因子和糖尿病肾病的病理变化及临床表现密切相关。fractalkine(FKN) 是目前发现的趋化因子CX3C家族的唯一成员,它是否在AGEs致DN肾小管间质病变的发病机制中发挥重要作用,值得深入研究和探讨。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂:新生小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所产品)、DMEM培养基(Gibco产品) 、Trizol总RNA提取试剂盒(TaKaRa产品)、RT-PCR试剂盒RevertAidTM First Stand cDNA Synthesis Kit MBI(Fermentas)产品、DNA Marker D2000(2000 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100bp)购自天为时代公司、FKN mRNA及β-actin mRNA引物委托上海生物工程公司合成。
1.1.2 AGE-BSA的制备:在PH 7.4的PBS溶液里加入BSA和不同量的葡萄糖,使BSA的终浓度为5.0 g/L,葡萄糖的终浓度为50 mmol/L,过滤除菌,PH 7.4 PBS溶液透析除去未结合的葡萄糖。对照组BSA中不含葡萄糖,其余条件一致。荧光光谱扫描分析鉴定AGE-BSA。
1.1.3 TEC的培养:首先将冻存的人肾小管上皮细胞(TEC)复苏,将细胞悬液移入培养瓶内,加适量培养液进行培养。
1.2 方法
1.2.1 实验分组及干预:实验设AGE组、对照组。将处于对数生长期的细胞按1∶3移入6孔板中,待细胞生长至80%～90%融合时,换用无血清的DMEM同步化饥饿24h后进行干预:①分别加入不同浓度(50、100、200、400 mg/L)的AGE-BSA对TEC干预24h;②加入200 mg/L 的AGE-BSA对TEC分别干预0、12、24、48h。用不含葡萄糖BSA和无血清培养基DMEM作为对照。
1.2.2 半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测FKN mRNA表达:按Trizol总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA,取2μg为模板逆转录。应用RT-PCR试剂盒进行FKN及β-actin的cDNA第一链合成,总反应体积25μl。取2μl cDNA进行PCR扩增,以1.7%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,用自动凝胶图像分析仪扫描凝胶图谱,用LabImage分析软件对DNA条带进行密度扫描分析,以特意扩增产物条带光密度值与内参照条带光密度值之比值作半定量分析。
1.3 统计学处理:计量数据以均数±标准差(x±s)表示,应用SPSS13.0统计软件分析数据,采用one-way ANOVA进行显著性检验,组间比较采用S-N-K检验,P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 不同浓度的AGE-BSA对TEC FKN mRNA表达的影响 :TEC在DMEM组和BSA组有少量FKN mRNA表达,FKN/β-actin mRNA光密度比值分别是:DMEM 0.675±0.039,BSA 0.761±0.078。50、100、200、400 mg/L的AGE-BSA干预后,各组细胞光密度比值分别是:0.880±0.082,0.904±0.060,0.991±0.152,1.125±0.174,FKN mRNA表达随AGE-BSA浓度增高而增高(P<0.05),400 mg/L时达到最高峰,100 mg/L以上各组光密度比值明显高于DMEM组及BSA组(均P<0.05)(见图1)。
2.2 AGE-BSA干预TEC不同时间对FKN mRNA表达的影响:用浓度为200 mg/L的AGE-BSA干预TEC 0、12、24、48h,各组的FKN/β-actin mRNA光密度比值分别是:BSA 0.628±0.065,0h 0.595±0.060,12h 0.676±0.058,24h 0.784±0.056,48h 0.982±0.287(P<0.05),干预12h TEC的FKN mRNA表达即已升高,蛋白分泌量较0h明显升高(P<0.05),并随干预时间的延长FKN mRNA水平进一步增高,48h达高峰(P<0.05)。(图2).
图1的DNA电泳图①Marker;②DMEM;③BSA(200mg/L);④AGE-BSA (50mg/L);⑤AGE-BSA (100mg/L);⑥AGE-BSA (200mg/L);⑦AGE-BSA (400mg/L)
图2的DNA电泳图①Marker;②BSA;③AGE-BSA干预0h;④AGE-BSA干预12h;⑤AGE-BSA干预24h;⑥AGE-BSA 干预48h
3 讨论
DN的发病机制非常复杂,目前尚未明确。长期以来,人们把研究和治疗重点放在肾小球损害上,但研究显示肾小管的损害在DN的发生、发展中同样重要,糖尿病患者尿白蛋白排泄率在正常范围时,就已经存在肾小管损害。肾小管间质病变程度是反映肾功能下降严重程度和判断预后最重要的指标,故对其机制的研究可以为临床防治DN有重要意义。其中高血糖引起蛋白质非酶糖基化导致的糖基化终末产物和一些炎性趋化因子在其中的相互作用及致病机制正逐渐被认识。
AGEs是由葡萄糖或其他还原糖与蛋白质的游离氨基端经一系列脱水、环化、氧化及重排等反应后形成的不可逆产物,大量研究结果显示,AGEs参与DN发生机制[2]。而炎症反应是DN发生发展中的重要环节之一[3]。在DN状态下由于存在的高糖和血流动力学障碍,引起肾脏固有细胞的损伤,释放前炎症介质,白细胞迁移至损伤部位,释放更多的趋化因子[4],刺激肾系膜细胞分泌胶原纤维、层粘连蛋白、纤连蛋白导致肾小球硬化。肾小管上皮细胞则分泌免疫介质、细胞因子,使肾脏间质单核/巨噬细胞聚集,导致肾间质纤维化[5]。既往研究已证实AGE-BSA干预肾系膜细胞后趋化因子家族中CC亚族MCP-1、RANTES表达增加[6],本实验进一步研究AGEs对肾小管上皮细胞CX3C亚族的趋化因子-FKN mRNA的表达影响,从而了解糖尿病肾小管间质病变可能机制。
FKN 是目前发现的CX3C家族的唯一成员[7],既具有趋化因子特性又具有粘附分子特性,以膜结合型和分泌型两种形式存在。Cockwell[8] 等研究证实FKN在肾系膜细胞、肾小管上皮细胞、肾小球和肾小管间质组织等都有表达,且与炎性组织的单个核细胞浸润显著相关,并认为FKN / CX3CR1是介导肾脏炎性细胞浸润的重要因子。由于一些与炎症相关的细胞因子 (TNF-α,IL-1, IFN-γ)能明显诱导FKN表达增加,Makita[9]等人发现DN患者增高的AGEs可诱导单核细胞趋化和激活,且AGEs可增加TNF-α, IL-1等细胞因子的表达和分泌。那么AGEs是否可能是通过增加FKN的表达来增强TEC趋化粘附炎性细胞的能力,从而导致糖尿病肾小管间质损害?目前尚未见AGEs诱导肾小管细胞表达FKN的有关报道。本实验中应用AGE-BSA干预体外培养的人肾小管上皮细胞(TEC),用RT-PCR法检测细胞FKN mRNA表达水平,发现AGE-BSA呈剂量和时间依赖性增加TEC FKN mRNA的表达, 从而提示FKN可能在AGEs致DN肾小管间质病变的发病机制中发挥重要作用。
本研究通过观察AGEs对体外培养的肾小管上皮细胞FKN mRNA 表达的影响，从细胞水平探讨AGEs和FKN相互作用对DN肾小管间质病变发生发展的影响，关于AGEs上调FKN表达的机制目前尚有待进一步阐明。, 百拇医药
[关键词]糖基化终产物;fractalkine;糖尿病肾病
[中图分类号]R587.2
[文献标识码]B
[文章编号]1006-1959(2009)11-0015-02
糖尿病肾病(DN)是糖尿病严重的微血管并发症之一,是导致终末期肾脏疾病最常见的原因。近期研究证实,糖尿病肾损伤不仅是肾小球的硬化,同时也发生在肾小管。许多研究显示糖基化终末产物(AGEs)形成与堆积是DN的主要发病机制之一[1]。近年来发现,细胞因子尤其趋化因子和糖尿病肾病的病理变化及临床表现密切相关。fractalkine(FKN) 是目前发现的趋化因子CX3C家族的唯一成员,它是否在AGEs致DN肾小管间质病变的发病机制中发挥重要作用,值得深入研究和探讨。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂:新生小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所产品)、DMEM培养基(Gibco产品) 、Trizol总RNA提取试剂盒(TaKaRa产品)、RT-PCR试剂盒RevertAidTM First Stand cDNA Synthesis Kit MBI(Fermentas)产品、DNA Marker D2000(2000 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100bp)购自天为时代公司、FKN mRNA及β-actin mRNA引物委托上海生物工程公司合成。
1.1.2 AGE-BSA的制备:在PH 7.4的PBS溶液里加入BSA和不同量的葡萄糖,使BSA的终浓度为5.0 g/L,葡萄糖的终浓度为50 mmol/L,过滤除菌,PH 7.4 PBS溶液透析除去未结合的葡萄糖。对照组BSA中不含葡萄糖,其余条件一致。荧光光谱扫描分析鉴定AGE-BSA。
1.1.3 TEC的培养:首先将冻存的人肾小管上皮细胞(TEC)复苏,将细胞悬液移入培养瓶内,加适量培养液进行培养。
1.2 方法
1.2.1 实验分组及干预:实验设AGE组、对照组。将处于对数生长期的细胞按1∶3移入6孔板中,待细胞生长至80%～90%融合时,换用无血清的DMEM同步化饥饿24h后进行干预:①分别加入不同浓度(50、100、200、400 mg/L)的AGE-BSA对TEC干预24h;②加入200 mg/L 的AGE-BSA对TEC分别干预0、12、24、48h。用不含葡萄糖BSA和无血清培养基DMEM作为对照。
1.2.2 半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测FKN mRNA表达:按Trizol总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA,取2μg为模板逆转录。应用RT-PCR试剂盒进行FKN及β-actin的cDNA第一链合成,总反应体积25μl。取2μl cDNA进行PCR扩增,以1.7%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,用自动凝胶图像分析仪扫描凝胶图谱,用LabImage分析软件对DNA条带进行密度扫描分析,以特意扩增产物条带光密度值与内参照条带光密度值之比值作半定量分析。
1.3 统计学处理:计量数据以均数±标准差(x±s)表示,应用SPSS13.0统计软件分析数据,采用one-way ANOVA进行显著性检验,组间比较采用S-N-K检验,P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 不同浓度的AGE-BSA对TEC FKN mRNA表达的影响 :TEC在DMEM组和BSA组有少量FKN mRNA表达,FKN/β-actin mRNA光密度比值分别是:DMEM 0.675±0.039,BSA 0.761±0.078。50、100、200、400 mg/L的AGE-BSA干预后,各组细胞光密度比值分别是:0.880±0.082,0.904±0.060,0.991±0.152,1.125±0.174,FKN mRNA表达随AGE-BSA浓度增高而增高(P<0.05),400 mg/L时达到最高峰,100 mg/L以上各组光密度比值明显高于DMEM组及BSA组(均P<0.05)(见图1)。
2.2 AGE-BSA干预TEC不同时间对FKN mRNA表达的影响:用浓度为200 mg/L的AGE-BSA干预TEC 0、12、24、48h,各组的FKN/β-actin mRNA光密度比值分别是:BSA 0.628±0.065,0h 0.595±0.060,12h 0.676±0.058,24h 0.784±0.056,48h 0.982±0.287(P<0.05),干预12h TEC的FKN mRNA表达即已升高,蛋白分泌量较0h明显升高(P<0.05),并随干预时间的延长FKN mRNA水平进一步增高,48h达高峰(P<0.05)。(图2).
图1的DNA电泳图①Marker;②DMEM;③BSA(200mg/L);④AGE-BSA (50mg/L);⑤AGE-BSA (100mg/L);⑥AGE-BSA (200mg/L);⑦AGE-BSA (400mg/L)
图2的DNA电泳图①Marker;②BSA;③AGE-BSA干预0h;④AGE-BSA干预12h;⑤AGE-BSA干预24h;⑥AGE-BSA 干预48h
3 讨论
DN的发病机制非常复杂,目前尚未明确。长期以来,人们把研究和治疗重点放在肾小球损害上,但研究显示肾小管的损害在DN的发生、发展中同样重要,糖尿病患者尿白蛋白排泄率在正常范围时,就已经存在肾小管损害。肾小管间质病变程度是反映肾功能下降严重程度和判断预后最重要的指标,故对其机制的研究可以为临床防治DN有重要意义。其中高血糖引起蛋白质非酶糖基化导致的糖基化终末产物和一些炎性趋化因子在其中的相互作用及致病机制正逐渐被认识。
AGEs是由葡萄糖或其他还原糖与蛋白质的游离氨基端经一系列脱水、环化、氧化及重排等反应后形成的不可逆产物,大量研究结果显示,AGEs参与DN发生机制[2]。而炎症反应是DN发生发展中的重要环节之一[3]。在DN状态下由于存在的高糖和血流动力学障碍,引起肾脏固有细胞的损伤,释放前炎症介质,白细胞迁移至损伤部位,释放更多的趋化因子[4],刺激肾系膜细胞分泌胶原纤维、层粘连蛋白、纤连蛋白导致肾小球硬化。肾小管上皮细胞则分泌免疫介质、细胞因子,使肾脏间质单核/巨噬细胞聚集,导致肾间质纤维化[5]。既往研究已证实AGE-BSA干预肾系膜细胞后趋化因子家族中CC亚族MCP-1、RANTES表达增加[6],本实验进一步研究AGEs对肾小管上皮细胞CX3C亚族的趋化因子-FKN mRNA的表达影响,从而了解糖尿病肾小管间质病变可能机制。
FKN 是目前发现的CX3C家族的唯一成员[7],既具有趋化因子特性又具有粘附分子特性,以膜结合型和分泌型两种形式存在。Cockwell[8] 等研究证实FKN在肾系膜细胞、肾小管上皮细胞、肾小球和肾小管间质组织等都有表达,且与炎性组织的单个核细胞浸润显著相关,并认为FKN / CX3CR1是介导肾脏炎性细胞浸润的重要因子。由于一些与炎症相关的细胞因子 (TNF-α,IL-1, IFN-γ)能明显诱导FKN表达增加,Makita[9]等人发现DN患者增高的AGEs可诱导单核细胞趋化和激活,且AGEs可增加TNF-α, IL-1等细胞因子的表达和分泌。那么AGEs是否可能是通过增加FKN的表达来增强TEC趋化粘附炎性细胞的能力,从而导致糖尿病肾小管间质损害?目前尚未见AGEs诱导肾小管细胞表达FKN的有关报道。本实验中应用AGE-BSA干预体外培养的人肾小管上皮细胞(TEC),用RT-PCR法检测细胞FKN mRNA表达水平,发现AGE-BSA呈剂量和时间依赖性增加TEC FKN mRNA的表达, 从而提示FKN可能在AGEs致DN肾小管间质病变的发病机制中发挥重要作用。
本研究通过观察AGEs对体外培养的肾小管上皮细胞FKN mRNA 表达的影响，从细胞水平探讨AGEs和FKN相互作用对DN肾小管间质病变发生发展的影响，关于AGEs上调FKN表达的机制目前尚有待进一步阐明。, 百拇医药