人线粒体融合蛋白—2基因真核表达载体的构建与鉴定
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摘要：目的 构建人线粒体融合蛋白-2 (mitofusin-2， MFN2)基因真核表达载体并对其进行鉴定。方法 在pEGFP-N1载体多克隆位点插入人MFN2基因编码区序列，酶切、测序验证是否插入及正确性。将所构建载体转染原代培养的人血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)，荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达；荧光定量PCR和Western blot分别检测MFN2 的mRNA及蛋白表达。结果 成功构建了人MFN2 基因真核表达载体，其转染VSMCs后，可以检测到MFN2 mRNA及蛋白水平高表达(P<0.01)。结论 成功构建了人MFN2基因真核表达载体，且能够在原代VSMC中过表达。
关键词：线粒体融合蛋白-2；载体构建；鉴定
血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells， VSMCs)的增殖是动脉粥样硬化(Atherosclerosis， AS)形成的中心环节。线粒体融合蛋白-2 (mitofusin-2， MFN2)是一种细胞增殖抑制因子，能抑制VSMCs增殖[1，2]。本研究拟通过构建人MFN2基因真核表达载体，并将其转染原代人脐静脉平滑肌细胞，荧光定量PCR法及Western blot检测MFN2 mRNA及蛋白表达，为今后研究MFN2在AS中的作用打下良好基础。
1资料与方法
1.1一般资料 原代人脐静脉平滑肌细胞由本实验室培养；DMEM培养基、胎牛血清、胰酶购自Hyclone公司；大肠杆菌感受态DH5α购自北京博迈德生物科技公司；真核基因表达载体pEGFP-N1购自 Clontech公司；Taq DNA 聚合酶购自宝生物公司；限制性内切酶Bgl II及EcoR I、T4 DNA连接酶均购自Fermentas 公司；逆转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒购自Fermentas公司；TRIzol试剂、转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；兔抗人MFN2抗体购自北京博奥森生物科技有限公司 ......
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