过表达Pitx3基因慢病毒表达载体的构建及稳定细胞株的建立(1)
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摘要：目的 构建并包装大鼠Pitx3基因过表达慢病毒并建立稳定过表达Pitx3基因的MES23.5 多巴胺能神经细胞株。方法 采用RT-PCR方法扩增Pitx3基因片段并将其连接于含有嘌呤霉素抗性的Plv-cs2.0-N-FLAG载体质粒，采用慢病毒包装四质粒系统(pRRE/pVSVS/pREV/pLV)，用转染试剂Lipofectamine 2000将四质粒按一定比例转染293T细胞；收集慢病毒上清并感染MES23.5细胞株，嘌呤霉素稳定表达Pitx3的MES23.5细胞株，Western blotting检测Pitx3蛋白的表达。结果 限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳结果表明在900bp处有一明显条带； Pitx3测序结果显示序列与gene bank上的序列完全一致；嘌呤霉素筛选病毒感染的MES23.5细胞，传代筛选第5代后细胞几乎无死亡现象；Western blotting结果显示，在分子量为43kDa处有相应条带。结论 成功构建过表达Pitx3基因的慢病毒表达载体并建立了稳定表达Pitx3基因的MES23.5细胞株，此研究为进一步探讨Pitx3基因的功能提供了良好的研究工具。
关键词：Pitx3；慢病毒；载体构建；过表达
帕金森病(Parkinson Disease，PD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，主要临床症状为静止性震颤、肌强直、动作减少和自主活动障碍等，主要的病理特征是中脑黑质多巴胺(Dopamine，DA)能神经细胞的慢性进行性变性死亡。胶质细胞系源性神经营养因子GDNF对受损的黑质DA能神经细胞具有很好的保护作用，如何促进内源性GDNF表达的增加是当前PD治疗的研究热点[1 ......
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