琼脂糖—纤维蛋白平板法测定纳豆冻干粉中纳豆激酶活性(1)
摘要：用琼脂糖-纤维蛋白平板法对纳豆冻干粉中纳豆激酶活性进行测定，在检测酶浓度单位在2000～10000U/ml时呈现很好的2次曲线关系，蚓激酶浓度单位-两垂直直径的乘积回归方程为y=-0.0000004839 x2+0.02203 x-12.2715，相关系数r2=0.9993。本法回收率范围在89.53%～100.75%，平均回收率为94.7%，RSD为4.2%。
关键词：琼脂糖；纤维蛋白；纳豆激酶；蚓激酶；平板法。
Activities of Nattokinase(NK)in Natto Freeze-dried Powder was Assessed by Agar-fibrin Plate Assay
YANG Zu-wei，DENG Yue-xin
(By-Health Co.Ltd，Zhuhai 519040，Guangdong 519040，China)
Abstract：The activities of Nattokinase(NK)in natto freeze-dried powder was assessed by agar-fibrin plate assay，it displays a good quadratic relations under the enzyme concentration of 0.30%～0.40%.The product of the regression equation between concentration of vermis kinase and two vertical diameter was y=-0.0000004839x2+0.02203-12.2715，The correlation coefficient was 0.9993.The recovery of the method was found to be in the range of 89.53%-100.75%，the average recovery was 94.7%，RSD=4.2%。
Key words：Agarose； Fibrin； Nattokinase； Lumbrokinase； Plate method
纳豆(Natto)是，以大豆为原料由纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis var.natto)发酵而成。纳豆激酶(Nattokinase，NK)是纳豆中的一种丝氨酸蛋白酶，具有强烈溶栓功效，实验研究证实该酶，成本低廉，溶栓效果好，作用迅速，药效时间长，而且安全性好，无任何毒副作用，成为新一代理想的预防和治疗栓塞的生化药物[1，2]。测定纳豆激酶活力的方法主要有琼脂糖-纤维蛋白平板法[3]、纤维蛋白块溶解时间法[4]、四肽底物法[5]、血清板法[6]和酶联反应吸附法[7]等。目前琼脂糖-纤维蛋白平板法是目前用的比较多的一种方法，是将琼脂糖、血纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液按一定比例混合，制成人工血栓平板。其原理是以凝血酶和纤维蛋白原作用生成的交联纤维蛋白为底物，酶活与溶解圈面积成线性关系，故可用溶解面积来表示纳豆激酶的溶纤维活性。
本文用琼脂糖-纤维蛋白平板法对纳豆冻干粉中纳豆激酶活性进行了测定，并对该法的线性关系，重现性，回收率进行了考察。
1资料与方法
1.1一般资料 生化培养箱，分析天平，打孔器(2mm)，游标卡尺，pH计，恒温水浴锅，琼脂糖，塑料培养皿(直径14cm)，牛纤维蛋白原(牛血)、取凝血酶(牛血)、蚓激酶标准品均来自中国食品药品检定所。
1.2试剂配制 工作溶液：取十二水磷酸氢二钠0.716g和氯化钠1.8g，加水溶解并稀释至200ml，此为A液；取二水磷酸二氢钠0.156g，加水溶解并稀释至100ml，此为B液，将A、B两液混合至pH7.8。1.5%琼脂糖溶液：取琼脂糖0.6g，加工作溶液40ml，加热溶解，置55℃水浴中保温。纤维蛋白原液：取牛纤维蛋白原(牛血)60mg，加工作溶液40ml溶解，在37℃水浴中保温。凝血酶溶液：取凝血酶(牛血)，加适量工作溶液制成每1ml中含6 BP单位的溶液。蚓激酶标准溶液：取蚓激酶标准品分别制成为每1ml中含2000、4000、6000、8000、10000U蚓激酶的标准溶液。
2实验方法
2.1标准曲线的绘制 将在55℃保温的1.5%琼脂糖溶液40ml加入在37℃水浴中保温的纤维蛋白原液40ml中，边摇匀边加入，再立即加入凝血酶溶液1ml，立即混匀，快速倒入直径14cm的塑料培养皿中(尽量不产生气泡)，室温水平放置1h，打孔，吸干加样孔里渗出的水，精密吸取蚓激酶标准品溶液10μl，点在同一平皿中，加盖，置37℃恒温培养箱中，反应18h后取出，用游标卡尺测量溶圈两垂直直径。以蚓激酶标准品的单位数为横坐标，蚓激酶标准品溶圈两垂直直径的乘积为纵坐标，得标准2次曲线回归方程。
2.2样品纳豆激酶含量测定 测定6批纳豆冻干粉，分别称取0.5g，加工作溶液定容至10ml，混匀。精密吸取0.5ml上清液，加0.5ml工作溶液，混匀，即为供试品溶液。取10μl供试品溶液按2.1项的方法测定，将供试品溶圈两垂直直径的乘积代入标准2次曲线回归方程，计算供试品效价单位数。
2.3重现性实验 称取同一批次的纳豆冻干粉5份，按照2.1项和2.2项下的方法进行操作，考察操作方法的重现性。
2.4回收率测定 称取纳豆冻干粉1g，共9份，分三组，每组三份，分别加工作溶液定容至10ml，混匀。分别精密吸取0.5ml上清液，加0.5ml工作溶液，混匀，即为供试品溶液。对每组分别进行80%、100%、120%做加标回收。按2.1项的方法进行测定。, 百拇医药(杨祖伟 邓月新)
关键词：琼脂糖；纤维蛋白；纳豆激酶；蚓激酶；平板法。
Activities of Nattokinase(NK)in Natto Freeze-dried Powder was Assessed by Agar-fibrin Plate Assay
YANG Zu-wei，DENG Yue-xin
(By-Health Co.Ltd，Zhuhai 519040，Guangdong 519040，China)
Abstract：The activities of Nattokinase(NK)in natto freeze-dried powder was assessed by agar-fibrin plate assay，it displays a good quadratic relations under the enzyme concentration of 0.30%～0.40%.The product of the regression equation between concentration of vermis kinase and two vertical diameter was y=-0.0000004839x2+0.02203-12.2715，The correlation coefficient was 0.9993.The recovery of the method was found to be in the range of 89.53%-100.75%，the average recovery was 94.7%，RSD=4.2%。
Key words：Agarose； Fibrin； Nattokinase； Lumbrokinase； Plate method
纳豆(Natto)是，以大豆为原料由纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis var.natto)发酵而成。纳豆激酶(Nattokinase，NK)是纳豆中的一种丝氨酸蛋白酶，具有强烈溶栓功效，实验研究证实该酶，成本低廉，溶栓效果好，作用迅速，药效时间长，而且安全性好，无任何毒副作用，成为新一代理想的预防和治疗栓塞的生化药物[1，2]。测定纳豆激酶活力的方法主要有琼脂糖-纤维蛋白平板法[3]、纤维蛋白块溶解时间法[4]、四肽底物法[5]、血清板法[6]和酶联反应吸附法[7]等。目前琼脂糖-纤维蛋白平板法是目前用的比较多的一种方法，是将琼脂糖、血纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液按一定比例混合，制成人工血栓平板。其原理是以凝血酶和纤维蛋白原作用生成的交联纤维蛋白为底物，酶活与溶解圈面积成线性关系，故可用溶解面积来表示纳豆激酶的溶纤维活性。
本文用琼脂糖-纤维蛋白平板法对纳豆冻干粉中纳豆激酶活性进行了测定，并对该法的线性关系，重现性，回收率进行了考察。
1资料与方法
1.1一般资料 生化培养箱，分析天平，打孔器(2mm)，游标卡尺，pH计，恒温水浴锅，琼脂糖，塑料培养皿(直径14cm)，牛纤维蛋白原(牛血)、取凝血酶(牛血)、蚓激酶标准品均来自中国食品药品检定所。
1.2试剂配制 工作溶液：取十二水磷酸氢二钠0.716g和氯化钠1.8g，加水溶解并稀释至200ml，此为A液；取二水磷酸二氢钠0.156g，加水溶解并稀释至100ml，此为B液，将A、B两液混合至pH7.8。1.5%琼脂糖溶液：取琼脂糖0.6g，加工作溶液40ml，加热溶解，置55℃水浴中保温。纤维蛋白原液：取牛纤维蛋白原(牛血)60mg，加工作溶液40ml溶解，在37℃水浴中保温。凝血酶溶液：取凝血酶(牛血)，加适量工作溶液制成每1ml中含6 BP单位的溶液。蚓激酶标准溶液：取蚓激酶标准品分别制成为每1ml中含2000、4000、6000、8000、10000U蚓激酶的标准溶液。
2实验方法
2.1标准曲线的绘制 将在55℃保温的1.5%琼脂糖溶液40ml加入在37℃水浴中保温的纤维蛋白原液40ml中，边摇匀边加入，再立即加入凝血酶溶液1ml，立即混匀，快速倒入直径14cm的塑料培养皿中(尽量不产生气泡)，室温水平放置1h，打孔，吸干加样孔里渗出的水，精密吸取蚓激酶标准品溶液10μl，点在同一平皿中，加盖，置37℃恒温培养箱中，反应18h后取出，用游标卡尺测量溶圈两垂直直径。以蚓激酶标准品的单位数为横坐标，蚓激酶标准品溶圈两垂直直径的乘积为纵坐标，得标准2次曲线回归方程。
2.2样品纳豆激酶含量测定 测定6批纳豆冻干粉，分别称取0.5g，加工作溶液定容至10ml，混匀。精密吸取0.5ml上清液，加0.5ml工作溶液，混匀，即为供试品溶液。取10μl供试品溶液按2.1项的方法测定，将供试品溶圈两垂直直径的乘积代入标准2次曲线回归方程，计算供试品效价单位数。
2.3重现性实验 称取同一批次的纳豆冻干粉5份，按照2.1项和2.2项下的方法进行操作，考察操作方法的重现性。
2.4回收率测定 称取纳豆冻干粉1g，共9份，分三组，每组三份，分别加工作溶液定容至10ml，混匀。分别精密吸取0.5ml上清液，加0.5ml工作溶液，混匀，即为供试品溶液。对每组分别进行80%、100%、120%做加标回收。按2.1项的方法进行测定。, 百拇医药(杨祖伟 邓月新)