加热法预防快速冷冻切片脱片的应用体会(1)
摘要：目的 探讨如何提高快速冷冻切片质量的技术和方法，防止快速冷冻切片脱片，提高快速冷冻切片的速度。方法 每日随机选取术中送检快速冷冻的新鲜标本，同一标本取两块相近组织，其中一块使用传统常温的快速冰冻切片方法进行制片，另一块使用自我摸索的载玻片加热"新方法"进行制片。然后将两种方法对照，并分别观察两组冷冻制片染色后的效果。结果 "加热组"的快速冷冻制片中只出现一例子宫肌瘤脱片，脱片发生率仅为0.2%。而"常温组"中却有26例发生不同程度掉片，脱片发生率为5.2%，且以子宫肌瘤和宫颈组织的脱片发生率最高。结论 使用载玻片加热的"新方法"进行快速冷冻切片能很好地防止组织脱片，可以有效缩短快速冷冻的制片时间。
关键词：快速冷冻切片；脱片；加热；速度；质量分析
在快速冷冻切片中，时间是快速冷冻切片的关键[1]。有些组织在制片过程中会发生脱片，再次切片必然会延缓快速冷冻切片速度，不能为诊断医生提供相对充裕的诊断报告时间。为此，我们尝试了一种新的快速冷冻制片方法(简称"新方法")进行不断尝试，旨在证明其是否真的可以防止快速冷冻切片的组织脱片。
1资料与方法
1.1一般资料 收集南京市妇幼保健院病理科快速冷冻送检的新鲜标本500例，每例取两块部位相近、厚薄一致且大小相似的组织。随机分为两组：其中一块组织使用传统规范的快速冷冻方法进行制片，另一块组织使用"新方法"进行快速冷冻切片。
1.2仪器 制片所用机器型号为德国莱卡CM1900冰冻切片机及其配套的组织托、OCT包埋剂、一次性刀片和甲醇固定液。
1.3方法
1.3.1常温组 这是传统方法。将待切组织块切面朝上，放在组织托中央，OCT包埋剂包埋，待组织块冷冻变硬后切片，常温下载玻片写上编号，然后进行贴片。载玻片贴片后立即放入固定液中固定，固定时间为10～15 s；水洗；苏木素2 min；水洗；盐酸酒精分化1 s；水洗；温水蓝化；伊红5～10 s；最后梯度酒精脱水、二甲苯透明及中性树胶封固。
1.3.2加热组 我们称其为"新方法"。将组织托放在流水下冲洗几秒钟，甩去多余的水，待切组织块切面朝上，放在组织托中央，OCT包埋剂包埋，待组织块冷冻变硬后切片。同时将载玻片写上编号放入恒温干燥箱(温度设置在65℃～75℃间)中加热约1 min，取出后在室温中稍加冷却即可贴片。贴片后的处理同传统常温组。
1.3.3切片评价 将两组切片交由两位不了解分组信息的病理医生镜下观察，然后按照江苏省诊断和技术规范对其进行评价。
2结果
通过将载玻片加热的"新方法"制作的快速冰冻切片，我们观察发现在具体切片环节与常温组无明显差异。经快速冷冻切片染色后，镜下观察细胞浆呈淡红色，细胞核呈蓝紫色，核浆对比分明，色泽鲜艳，无皱褶，组织结构清晰，层次分明。其质量与常温组冷冻切片相比不相上下，甚至在某些方面胜过常温组制片质量。更重要的是，"新方法"中快速冷冻切片组织几乎不出现脱片，基本不需要重新制片，有效地提高了快速冷冻的切片时间和切片质量，见图1～6。由图可见，宫颈、软骨及乳腺脂肪组织在快速冷冻切片常规制作中很容易发生脱片，而我们的新方法"加热组"中则能使切片保持较好的完整性。如表1所示，我们分别选取了妇产科常见的几种不同瘤体组织，具体包括乳腺、子宫肌瘤/腺肌瘤、卵巢肿瘤、子宫内膜及宫颈疾病组织。"新方法"的快速冷冻制片中只出现一例子宫肌瘤脱片，脱片发生率仅为0.2%。而常温组中却有26例发生不同程度脱片掉片，脱片发生率为5.2%。其中，子宫肌瘤和宫颈组织在传统常温冷冻制片中的脱片发生率最高，见表1。"加热组"的脱片发生率与"常温组"相比有很大差异，且差异有统计学意义(P<0.05；χ2=23.790，P=0.000)。
3讨论
3.1快速冷冻切片的基本条件及注意事项[10]
3.1.1要做好准备工作。首先刀要锋利，一次性刀片要定时更换。要保证冷冻切片机24h处于备用状态，预定好冷冻温度和除霜时间。
3.1.2在恒温干燥箱中烤切片，时间不能过长，以不超过1min为宜，否则会使组织干燥而影响染色。
3.1.3切片手法要熟练，技术员要熟练掌握机器性能和冷冻切片方法，熟练掌握不同组织的适宜温度和其他相关条件，只有不断实践才能逐步积累经验。
3.1.4冷冻切片通常比石蜡切片厚，细胞由于未固定往往偏大。在制片过程中要根据不同的组织调节不同的温度，有时温度过低会使组织过脆、切片撕裂；带有脂肪的组织往往不易成片而引起折叠，有时染色不佳影响观察，或冷冻过度时细胞内会出现冰晶现象。
3.1.5术中冷冻切片快速诊断，要求病理医师准确取材，不要仅限1块，应取2～3块为最佳，并要求技术员要认真仔细观察不断总结经验才能制作良好切片，保证冷冻诊断质量。
3.2影响组织切片脱片的因素
3.2.1载玻片不干净 载玻片一定要干净，如果载玻片不干净，可能导致脱片或者影响镜下观察[8]。一般不建议用防脱玻片，防脱玻片上面的粘附剂会与后面染色试剂发生反应，从而影响镜下观察。最好直接使用常规载玻片预热的方法对组织进行快速冷冻切片，此方法简单，制作时间短，切片质量好，术后诊断符合率98%以上，与常规HE切片染色无明显差别。
3.2.2温度 快速冷冻切片是利用组织切片和载玻片的温度差将组织切片贴附到载玻片上，适当增加两者的温度差可以减少组织脱片。
3.2.3切片太厚 调好切片的厚度，以4～6 μm为宜。
3.2.4固定液浓度过低 定期更换固定液，保证固定液的浓度。
3.2.5组织内含过多的坏死和脂肪组织 避免过多的坏死和脂肪组织[6]，延长固定时间，用酒精灯适当烤一烤，增加组织与玻片的粘贴。, 百拇医药(吴王飞 陈迅 程雪 张静敏 纪捷 李青)
关键词：快速冷冻切片；脱片；加热；速度；质量分析
在快速冷冻切片中，时间是快速冷冻切片的关键[1]。有些组织在制片过程中会发生脱片，再次切片必然会延缓快速冷冻切片速度，不能为诊断医生提供相对充裕的诊断报告时间。为此，我们尝试了一种新的快速冷冻制片方法(简称"新方法")进行不断尝试，旨在证明其是否真的可以防止快速冷冻切片的组织脱片。
1资料与方法
1.1一般资料 收集南京市妇幼保健院病理科快速冷冻送检的新鲜标本500例，每例取两块部位相近、厚薄一致且大小相似的组织。随机分为两组：其中一块组织使用传统规范的快速冷冻方法进行制片，另一块组织使用"新方法"进行快速冷冻切片。
1.2仪器 制片所用机器型号为德国莱卡CM1900冰冻切片机及其配套的组织托、OCT包埋剂、一次性刀片和甲醇固定液。
1.3方法
1.3.1常温组 这是传统方法。将待切组织块切面朝上，放在组织托中央，OCT包埋剂包埋，待组织块冷冻变硬后切片，常温下载玻片写上编号，然后进行贴片。载玻片贴片后立即放入固定液中固定，固定时间为10～15 s；水洗；苏木素2 min；水洗；盐酸酒精分化1 s；水洗；温水蓝化；伊红5～10 s；最后梯度酒精脱水、二甲苯透明及中性树胶封固。
1.3.2加热组 我们称其为"新方法"。将组织托放在流水下冲洗几秒钟，甩去多余的水，待切组织块切面朝上，放在组织托中央，OCT包埋剂包埋，待组织块冷冻变硬后切片。同时将载玻片写上编号放入恒温干燥箱(温度设置在65℃～75℃间)中加热约1 min，取出后在室温中稍加冷却即可贴片。贴片后的处理同传统常温组。
1.3.3切片评价 将两组切片交由两位不了解分组信息的病理医生镜下观察，然后按照江苏省诊断和技术规范对其进行评价。
2结果
通过将载玻片加热的"新方法"制作的快速冰冻切片，我们观察发现在具体切片环节与常温组无明显差异。经快速冷冻切片染色后，镜下观察细胞浆呈淡红色，细胞核呈蓝紫色，核浆对比分明，色泽鲜艳，无皱褶，组织结构清晰，层次分明。其质量与常温组冷冻切片相比不相上下，甚至在某些方面胜过常温组制片质量。更重要的是，"新方法"中快速冷冻切片组织几乎不出现脱片，基本不需要重新制片，有效地提高了快速冷冻的切片时间和切片质量，见图1～6。由图可见，宫颈、软骨及乳腺脂肪组织在快速冷冻切片常规制作中很容易发生脱片，而我们的新方法"加热组"中则能使切片保持较好的完整性。如表1所示，我们分别选取了妇产科常见的几种不同瘤体组织，具体包括乳腺、子宫肌瘤/腺肌瘤、卵巢肿瘤、子宫内膜及宫颈疾病组织。"新方法"的快速冷冻制片中只出现一例子宫肌瘤脱片，脱片发生率仅为0.2%。而常温组中却有26例发生不同程度脱片掉片，脱片发生率为5.2%。其中，子宫肌瘤和宫颈组织在传统常温冷冻制片中的脱片发生率最高，见表1。"加热组"的脱片发生率与"常温组"相比有很大差异，且差异有统计学意义(P<0.05；χ2=23.790，P=0.000)。
3讨论
3.1快速冷冻切片的基本条件及注意事项[10]
3.1.1要做好准备工作。首先刀要锋利，一次性刀片要定时更换。要保证冷冻切片机24h处于备用状态，预定好冷冻温度和除霜时间。
3.1.2在恒温干燥箱中烤切片，时间不能过长，以不超过1min为宜，否则会使组织干燥而影响染色。
3.1.3切片手法要熟练，技术员要熟练掌握机器性能和冷冻切片方法，熟练掌握不同组织的适宜温度和其他相关条件，只有不断实践才能逐步积累经验。
3.1.4冷冻切片通常比石蜡切片厚，细胞由于未固定往往偏大。在制片过程中要根据不同的组织调节不同的温度，有时温度过低会使组织过脆、切片撕裂；带有脂肪的组织往往不易成片而引起折叠，有时染色不佳影响观察，或冷冻过度时细胞内会出现冰晶现象。
3.1.5术中冷冻切片快速诊断，要求病理医师准确取材，不要仅限1块，应取2～3块为最佳，并要求技术员要认真仔细观察不断总结经验才能制作良好切片，保证冷冻诊断质量。
3.2影响组织切片脱片的因素
3.2.1载玻片不干净 载玻片一定要干净，如果载玻片不干净，可能导致脱片或者影响镜下观察[8]。一般不建议用防脱玻片，防脱玻片上面的粘附剂会与后面染色试剂发生反应，从而影响镜下观察。最好直接使用常规载玻片预热的方法对组织进行快速冷冻切片，此方法简单，制作时间短，切片质量好，术后诊断符合率98%以上，与常规HE切片染色无明显差别。
3.2.2温度 快速冷冻切片是利用组织切片和载玻片的温度差将组织切片贴附到载玻片上，适当增加两者的温度差可以减少组织脱片。
3.2.3切片太厚 调好切片的厚度，以4～6 μm为宜。
3.2.4固定液浓度过低 定期更换固定液，保证固定液的浓度。
3.2.5组织内含过多的坏死和脂肪组织 避免过多的坏死和脂肪组织[6]，延长固定时间，用酒精灯适当烤一烤，增加组织与玻片的粘贴。, 百拇医药(吴王飞 陈迅 程雪 张静敏 纪捷 李青)