糖化血红蛋白检测方法与研究进展(1)
摘要：检验糖化血红蛋白已经成为了糖尿病监控检测的标准诊断方式，对糖尿病患者早期的筛查和确诊起到了不可替代的作用。近年出现了很多与糖化血红蛋白检测方法相关的文献和研究，并根据不同的检测原理对其方法进行了科学系统的分类，本文对此进行研究和总结。
关键词：糖化血红蛋白；检测方法；研究进展
糖化血红蛋白是血红蛋白和血液中葡萄糖缓慢、连续的非酶促不可逆反应的产物，它不会受到暂时性血糖的作用和影响。因此，糖化血红蛋白对于高血糖，尤其是血糖波动比较大的糖尿病患者具有很高的诊断价值，属于长期控制血糖水平的重要指标，患者血液中糖化血红蛋白的含量能够反映其在过去2、3个月的平均血糖水平，反映糖尿病患者体内糖代谢水平的病情控制程度。
1 糖化血红蛋白的来源
糖化血红蛋白是血红蛋白和血液中葡萄糖缓慢、连续的非酶促不可逆反应的产物，而HbA1c结构较为稳定，约占糖化血红蛋白的65%左右。合成糖化血红蛋白的不可逆性使得它可以在患者体内蓄积，并贯穿在红细胞的整个生命周期中，同时受到红细胞葡萄糖浓度的影响，两者形成正比，所以血液中的葡萄糖浓度越高，与血红蛋白反映产生的糖化血红蛋白也就越高，因此糖化血红蛋白的检测结果具有很强的说服力和稳定性，准确反映患者在2、3个月时间内对血糖病情的控制情况，在临床上有很高的参考价值。
, 百拇医药
2 糖化血红蛋白的检测方法
早在1968年，Rahbar就已经证实了HbA1c是糖尿病患者的红细胞中存在的一种异常的血红蛋白，它与糖尿病有着非常密切的联系。如今，检测糖化血红蛋白的方法已经超过了30种，可以根据性质与原理的不同类型。
2.1糖化、非糖化血红蛋白电荷的差异
2.1.1离子交换HPLC法 这种方法是当前分析检测HbA1c的标准方法，原理是依据pH7.0基础上HbA1c不带正电荷，非糖基化的HbA带正电荷，可以通过弱酸性阳离子离子交换层析将其与其他HbAlb、HbAla等区分开，同样根据这个原理目前也已经开发了专业的仪器检测分析糖化血红蛋白，对全血中的HbA1c直接进行测定，检测的结果不会受到异型血红蛋白和衍生物的影响，检测精密度很好，标本的检测速度也非常快，适合大批量标准同时进行测定。这种仪器在美国糖尿病控制及并发症实验研究中使用过，但是由于仪器过于昂贵，在当前我国基层医院和实验室中很难得到普及。
, http://www.100md.com
2.1.2电泳方法 电泳方法的原理是血红蛋白A的β链，因为发生糖基化导致所带电荷几乎消失，在电场中涌动比较缓慢，而糖化血红蛋白显示为红色，因此电泳结束以后可以直接通过对比颜色或是扫描的方式得到糖化血红蛋白占Hb的比例。采用毛细管电泳对HbA1c进行测定，结果发现它不会受到糖化血红蛋白变异体的影响。电泳方法使用比较稳定，具有较好的重现性，简单且快捷，但是当前并没有实现商品化价值，仪器也比较昂贵。
2.1.3等电聚焦方法 这种方法属于一种比较新的方法，是通过在凝胶上形成一个由正极到负极递增的pH梯度，溶血液中各组分成的HbA、HbC、HbF等移动到各自的等电点pH位置上，从而形成相对集中的带条，分离的效果比常规的电泳方式要好得多，会由于成分不同而经过精密光密度仪扫描处理以后做精确的定量。这种方法不会受到太多干扰物的影响，检测的效果比较好，但是仪器的价格比较高，也很难在基层单位的常规检测中得到很好的普及。
2.1.4微柱法 每组的电荷性质与数量都不相同，与离子交换剂的交换吸附能力也不相同，所以这种性质就成为了微柱法所采用的原理。当前在国外的很多公司都采用这种产品，它可以全自动分离血红蛋白的变异体与亚型，测定糖化血红蛋白的同时可以自动扣除各种干扰物质的作用，保证了结果的准确性与可靠性，同时价格上也比较便宜，满足了很多基层医院使用的条件。但是手工微柱进行操作容易产生误差，重复性也不够好，且受到外界的影响比较大。
, http://www.100md.com
2.2血红蛋白上糖化基团结构的特点
2.2.1亲和层析法 该方法采用硼酸能够可逆结合含有顺位二醇基的化合物特性，血红蛋白在发生糖化反应之后，因为结合的葡萄糖含有顺位二醇基，硼酸能够与糖化血红蛋白相结合，没有糖化的血红蛋白就不能与其结合而被洗脱流出柱子，再采用较高浓度的含顺位二醇基复合物或者是葡萄糖溶液将其结合到柱子上的糖化血红蛋白完全洗脱出来，成功分离。其优势是不会受到异常Hb的影响，操作比较简单和快捷，而且密度高，价格优惠。因为血液中存在的糖类都能与血红蛋白发生作用从而相结合，所以最后测定出来的结果不是单一HbA1c含量，而是样品中所有糖化血红蛋白的含量。在长期的研究实验中，其检测结果与高效液相等方法测定上结果都与高度有一定的关系，所以检测的结果对糖尿病患者的检测结果比较准确，是理想的检测指标。
2.2.2酶法 酶法是利用果糖基反应的特点，能够特异性作用于糖基化小肽，于是产生H2O2，再利用辣根过氧化物酶与之结合反应出色原先色。这一原理的利用，血液样品中的血红蛋白会先被蛋白酶水解，产生糖基化的小肽在辣根过氧化物酶的作用下会与特定的色原产生显色反应。这种方法在操作上比较简单方便，不会受到变异血红蛋白的影响，同时还能应用与自动生化分析仪，重复性与特异性都非常好。此外，利用酶法还能直接对样品HbA1c的百分含量进行测定，与其他方法相比，减少了测定样品血红蛋白总量的步骤，与HPLC法和免疫法相比有良好的相关性。
2.3抗原抗体反应
2.3.1免疫比浊法 这种方法是利用抗体与抗原的特异性反应，抗HbA1c的多克隆抗体或是单克隆抗体可以特异性地对HbA1cβ链N-末端最后4-6个氨基酸进行识别，对样品中HbA1c含量以及血红蛋白的含量进行测定，最后通过计算得出HbA1c占红蛋白的百分数。其优势在于花费的时间较短，操作简单，成本较低，重复性较好，缺点是容易受到黄疸等样本因素的影响，在抗交叉污染方面较差，线性范围也比较小。此外，还发现变异血红蛋白会对检测的结果产生影响，结果出现不稳定的情况比较多。, 百拇医药(蒋园园)
关键词：糖化血红蛋白；检测方法；研究进展
糖化血红蛋白是血红蛋白和血液中葡萄糖缓慢、连续的非酶促不可逆反应的产物，它不会受到暂时性血糖的作用和影响。因此，糖化血红蛋白对于高血糖，尤其是血糖波动比较大的糖尿病患者具有很高的诊断价值，属于长期控制血糖水平的重要指标，患者血液中糖化血红蛋白的含量能够反映其在过去2、3个月的平均血糖水平，反映糖尿病患者体内糖代谢水平的病情控制程度。
1 糖化血红蛋白的来源
糖化血红蛋白是血红蛋白和血液中葡萄糖缓慢、连续的非酶促不可逆反应的产物，而HbA1c结构较为稳定，约占糖化血红蛋白的65%左右。合成糖化血红蛋白的不可逆性使得它可以在患者体内蓄积，并贯穿在红细胞的整个生命周期中，同时受到红细胞葡萄糖浓度的影响，两者形成正比，所以血液中的葡萄糖浓度越高，与血红蛋白反映产生的糖化血红蛋白也就越高，因此糖化血红蛋白的检测结果具有很强的说服力和稳定性，准确反映患者在2、3个月时间内对血糖病情的控制情况，在临床上有很高的参考价值。
, 百拇医药
2 糖化血红蛋白的检测方法
早在1968年，Rahbar就已经证实了HbA1c是糖尿病患者的红细胞中存在的一种异常的血红蛋白，它与糖尿病有着非常密切的联系。如今，检测糖化血红蛋白的方法已经超过了30种，可以根据性质与原理的不同类型。
2.1糖化、非糖化血红蛋白电荷的差异
2.1.1离子交换HPLC法 这种方法是当前分析检测HbA1c的标准方法，原理是依据pH7.0基础上HbA1c不带正电荷，非糖基化的HbA带正电荷，可以通过弱酸性阳离子离子交换层析将其与其他HbAlb、HbAla等区分开，同样根据这个原理目前也已经开发了专业的仪器检测分析糖化血红蛋白，对全血中的HbA1c直接进行测定，检测的结果不会受到异型血红蛋白和衍生物的影响，检测精密度很好，标本的检测速度也非常快，适合大批量标准同时进行测定。这种仪器在美国糖尿病控制及并发症实验研究中使用过，但是由于仪器过于昂贵，在当前我国基层医院和实验室中很难得到普及。
, http://www.100md.com
2.1.2电泳方法 电泳方法的原理是血红蛋白A的β链，因为发生糖基化导致所带电荷几乎消失，在电场中涌动比较缓慢，而糖化血红蛋白显示为红色，因此电泳结束以后可以直接通过对比颜色或是扫描的方式得到糖化血红蛋白占Hb的比例。采用毛细管电泳对HbA1c进行测定，结果发现它不会受到糖化血红蛋白变异体的影响。电泳方法使用比较稳定，具有较好的重现性，简单且快捷，但是当前并没有实现商品化价值，仪器也比较昂贵。
2.1.3等电聚焦方法 这种方法属于一种比较新的方法，是通过在凝胶上形成一个由正极到负极递增的pH梯度，溶血液中各组分成的HbA、HbC、HbF等移动到各自的等电点pH位置上，从而形成相对集中的带条，分离的效果比常规的电泳方式要好得多，会由于成分不同而经过精密光密度仪扫描处理以后做精确的定量。这种方法不会受到太多干扰物的影响，检测的效果比较好，但是仪器的价格比较高，也很难在基层单位的常规检测中得到很好的普及。
2.1.4微柱法 每组的电荷性质与数量都不相同，与离子交换剂的交换吸附能力也不相同，所以这种性质就成为了微柱法所采用的原理。当前在国外的很多公司都采用这种产品，它可以全自动分离血红蛋白的变异体与亚型，测定糖化血红蛋白的同时可以自动扣除各种干扰物质的作用，保证了结果的准确性与可靠性，同时价格上也比较便宜，满足了很多基层医院使用的条件。但是手工微柱进行操作容易产生误差，重复性也不够好，且受到外界的影响比较大。
, http://www.100md.com
2.2血红蛋白上糖化基团结构的特点
2.2.1亲和层析法 该方法采用硼酸能够可逆结合含有顺位二醇基的化合物特性，血红蛋白在发生糖化反应之后，因为结合的葡萄糖含有顺位二醇基，硼酸能够与糖化血红蛋白相结合，没有糖化的血红蛋白就不能与其结合而被洗脱流出柱子，再采用较高浓度的含顺位二醇基复合物或者是葡萄糖溶液将其结合到柱子上的糖化血红蛋白完全洗脱出来，成功分离。其优势是不会受到异常Hb的影响，操作比较简单和快捷，而且密度高，价格优惠。因为血液中存在的糖类都能与血红蛋白发生作用从而相结合，所以最后测定出来的结果不是单一HbA1c含量，而是样品中所有糖化血红蛋白的含量。在长期的研究实验中，其检测结果与高效液相等方法测定上结果都与高度有一定的关系，所以检测的结果对糖尿病患者的检测结果比较准确，是理想的检测指标。
2.2.2酶法 酶法是利用果糖基反应的特点，能够特异性作用于糖基化小肽，于是产生H2O2，再利用辣根过氧化物酶与之结合反应出色原先色。这一原理的利用，血液样品中的血红蛋白会先被蛋白酶水解，产生糖基化的小肽在辣根过氧化物酶的作用下会与特定的色原产生显色反应。这种方法在操作上比较简单方便，不会受到变异血红蛋白的影响，同时还能应用与自动生化分析仪，重复性与特异性都非常好。此外，利用酶法还能直接对样品HbA1c的百分含量进行测定，与其他方法相比，减少了测定样品血红蛋白总量的步骤，与HPLC法和免疫法相比有良好的相关性。
2.3抗原抗体反应
2.3.1免疫比浊法 这种方法是利用抗体与抗原的特异性反应，抗HbA1c的多克隆抗体或是单克隆抗体可以特异性地对HbA1cβ链N-末端最后4-6个氨基酸进行识别，对样品中HbA1c含量以及血红蛋白的含量进行测定，最后通过计算得出HbA1c占红蛋白的百分数。其优势在于花费的时间较短，操作简单，成本较低，重复性较好，缺点是容易受到黄疸等样本因素的影响，在抗交叉污染方面较差，线性范围也比较小。此外，还发现变异血红蛋白会对检测的结果产生影响，结果出现不稳定的情况比较多。, 百拇医药(蒋园园)