HPLC法测定不同产地桑椹药材中柠檬酸成分的含量
摘要：目的 建立测定桑椹药材中柠檬酸含量的方法，并测定其在不同桑椹药材中的含量。方法 桑椹药材采用水作为溶剂加热回流提取，利用HPLC法，采用KromasilC18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；使用0.6%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱；流速为0.5ml/min-1；以209nm为检测波长；柱温为30℃。结果 柠檬酸对照品在0.10320～1.72000mg/ml-1质量浓度范围内线性关系良好(r=0.9999)；精密度的RSD值为1.01%(n=6)；测得平均加样回收率为98.29%，RSD值为0.93%(n=6)。结论 该方法简便、准确、易行，可用于桑椹药材的质量控制。
关键词：桑椹药材；柠檬酸；HPLC法
中图分类号：R284.1 文献标识码：A
桑椹，又名桑椹子、桑果、桑子、是桑科桑属mulberry(Morus alba L.)植物的果实。本属植物全球约有16种，分布于北温带、亚洲热带和非洲热带及美洲地区。我国约有11种，分布于全国大部分地区，以江苏、浙江等南方养蚕地区产量较大[1]。1993年国家卫生部把桑椹列为“既是食品又是药品”的农产品之一[2]。
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桑椹中含有丰富的糖类、有机酸、脂类、维生素、色素、非色素酚和矿物质等成分[3]。目前，在桑椹营养成分的研究的基础上，国内外对桑椹中功效成分的研究较多，主要集中在桑椹色素、非色素酚、及多糖等成分上。柠檬酸是其中含量较高的有机酸[4]，同时其具广泛的药理作用：①柠檬能防止心血管动脉硬化并减少血液粘稠度；②中国中医认为，柠檬性温、味苦、无毒，具有止渴生津、祛暑安胎、疏滞、健胃、止痛等功能利尿，调剂血管通透性；③柠檬酸热量低，且具有很强的收缩性，因此有利于减少脂肪，是减肥良药；④具有防止和消除皮肤色素沉着的作用；⑤袪痰作用等[5-7]。因此，本文建立一种准确定量桑椹药材中的柠檬酸含量的方法。
1 仪器与试药
1.1仪器 岛津高效液相色谱仪(Prominence UFLC)，日本岛津公司；1/10万电子分析天平，型号ME235S，德国塞多利斯公司；电热套(1000 ml)，上海科析实验仪器厂；KQ-300DE数控超声波发生器，昆山超声仪器有限公司。
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1.2试药 磷酸，AR级，天津市富宇精细化工有限公司；水，自制；柠檬酸(批号111679-200401)对照品，购自中国食品药品检定研究院；桑椹药材：安徽产地(批号20150412、20150415)，新疆药材(批号20150418、20150419、20150421)，较广产地批号(20150422)，河南产地(批号20150508)，江苏产地(批号20150428)，四川产地(批号20150502)，陕西产地(批号20150427)由陕西君碧莎制药有限公司提供。
2 实验方法
2.1色谱条件 色谱柱为Kromasil C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：0.6% 磷酸水溶液；检测波长：209 nm；流速：0.5 ml/min；柱温：30℃；进样量10 μl。
2.2对照品溶液的配制 精密称取柠檬酸对照品17.2 mg，置10 ml容量瓶，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，超声并摇匀，滤过，取续虑液，作为母液，备用。
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2.3供试品溶液的制备 取样品粉末(过4号筛)2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入蒸馏水100 ml，称定重量，加热回流提取1 h，放冷，再精密称定重量，用水补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.4标准曲线及线性范围 量取母液0.30，0.50，1.00，2.00， 4.00 ml，分别置于5 ml量瓶中，加蒸馏水溶解并定容至刻度，滤过，分别得到浓度为0.10320、0.17200、0.34400、0.68800、1.37600 mg/ml的对照品溶液，按上述条件测定峰面积，以对照品峰面积值(y)为纵坐标，柠檬酸浓度(x)为横坐标进行线性回归。结果：柠檬酸的质量浓度范围(mg/ml)、线性方程及相关系数(r)分别为：线性范围为0.10320～1.72000 mg/ml，回归方程为y=1278680x+1614，r=0.9999。结果表明对照品在相应浓度范围内线性关系良好。
2.5精密度实验 精密量取线性样品溶液(浓度为1.72 mg/ml)1.07 ml于5 ml量瓶中加蒸馏水至定容至刻度，得浓度为0.36808 mg/ml，按上述色谱条件重复进样6次，测得柠檬酸峰面积值的RSD分别为1.01%。结果表明该方法精密度良好。
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2.6稳定性实验 取精密度试验样品溶液(浓度为0.36808 mg/ml)，每间隔一定时间进样一次，测定柠檬酸对照品峰面积的RSD值分别为2.28%。结果表明柠檬酸对照品峰面积值在8 h内稳定。
2.7加样回收实验 采用加样回收法，取已测知含量的样品(江苏产，批号20150428，含量为5.140%)，精密称取柠檬酸对照品50.00 mg加入其中。按供试品溶液制备法操作，并按上述色谱条件进行测定，计算回收率。柠檬酸平均加样回收率为98.29%，结果表明本方法具有良好的回收率。
2.8重复性实验 精密称取样品(江苏产，批号20150428，含量5.140%)2.0000 g，按照供试品方法制备6份样品，按上述色谱条件进样测定，结果柠檬酸含量的RSD值分别为0.63%。结果表明本方法稳定。
2.9不同产地桑椹药材中柠檬酸含量的测定 分别精密量取供试品溶液10 μl，按前述色谱条件进样，测定峰面积，在此检测条件下，柠檬酸能够很好地分离。
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3 实验结果
3.1色谱图 柠檬酸对照品色谱图与供试品色谱图，见图1、图2。
3.2 桑椹中柠檬酸的测定结果，见表1。
4 讨论
4.1流动相的选择 实验中考察了1.0%醋酸与0.6%磷酸2种系统梯度洗脱及其不同流动相比例，比较的磷酸浓度有0.1%，0.3%，0.6%，1.0%水溶液。结果表明，各种流动相中0.6%磷酸水溶液系统为最佳，其图谱上各个色谱峰的分离度较好，保留时间适中，因此选此流动相系统作为桑椹药材中柠檬酸含量指标检测的流动相。
4.2制样方法 比较了用水作为溶剂超声提取与用水作为溶剂加热回流提取。结果表明，用水作为溶剂加热回流提取得到的峰面积较大、峰个数较多、分离度较好，所以选择用加热回流的方式提取。
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4.3其他 比较了不同柱温与流速，柱温超过30℃分析时间缩短，但大多数色谱峰分离度小或不能分开；流速<0.5 ml/min分析时间过长，>0.5 ml/min大多数色谱峰分离度差。因此选择便于控制的柱温30℃与流速 0.5 ml/min作为色谱条件。
综上所述，通过测定不同产地桑椹药材中柠檬酸成分含量的研究，表明该方法稳定可靠，单用液相色谱仪即可，避开了液相色谱与质谱连用的限制，使检测简单化。由于桑椹药材中的柠檬酸含量较高，且作用广泛，可用于桑椹药材的质量控制。
参考文献：
[1]施青红，王向阳.桑椹的功能成分及药理作用[J].专论与综述，2007，23(07)：153-154.
[2]孙波，周洪英，李勇，等.桑椹成分研究进展[J].北方蚕叶，2010，31(1)：4-8.
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[3]夏英杰，谭振鹏，王柳萍，等.药食两用中药桑椹的研究进展[J].中国医药科学，2013，3(3)：52-54.
[4]张志强，杨清香，孙来华，等.桑葚的开发及利用现状[J].中国食品添加剂，2009，24(2)：65-68.
[5]郑俊民.药用辅料手册[M].北京：化学工业出版社，2004：184-187.
[6]乐伟波，龚德华.枸橼酸的代谢动力学及其在连续性血液净化中的应用[J].医学继续教育，2009，18(4)：363-366.
[7]汪多仁.柠檬酸的开发与应用进展[J].精细化工原料及中间体，2011，20(9)：32-35.
编辑/翟辰万, http://www.100md.com(刘洋 肖会敏 何悦 史萌 刘海月 张俏 王四旺 唐志书)
关键词：桑椹药材；柠檬酸；HPLC法
中图分类号：R284.1 文献标识码：A
桑椹，又名桑椹子、桑果、桑子、是桑科桑属mulberry(Morus alba L.)植物的果实。本属植物全球约有16种，分布于北温带、亚洲热带和非洲热带及美洲地区。我国约有11种，分布于全国大部分地区，以江苏、浙江等南方养蚕地区产量较大[1]。1993年国家卫生部把桑椹列为“既是食品又是药品”的农产品之一[2]。
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桑椹中含有丰富的糖类、有机酸、脂类、维生素、色素、非色素酚和矿物质等成分[3]。目前，在桑椹营养成分的研究的基础上，国内外对桑椹中功效成分的研究较多，主要集中在桑椹色素、非色素酚、及多糖等成分上。柠檬酸是其中含量较高的有机酸[4]，同时其具广泛的药理作用：①柠檬能防止心血管动脉硬化并减少血液粘稠度；②中国中医认为，柠檬性温、味苦、无毒，具有止渴生津、祛暑安胎、疏滞、健胃、止痛等功能利尿，调剂血管通透性；③柠檬酸热量低，且具有很强的收缩性，因此有利于减少脂肪，是减肥良药；④具有防止和消除皮肤色素沉着的作用；⑤袪痰作用等[5-7]。因此，本文建立一种准确定量桑椹药材中的柠檬酸含量的方法。
1 仪器与试药
1.1仪器 岛津高效液相色谱仪(Prominence UFLC)，日本岛津公司；1/10万电子分析天平，型号ME235S，德国塞多利斯公司；电热套(1000 ml)，上海科析实验仪器厂；KQ-300DE数控超声波发生器，昆山超声仪器有限公司。
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1.2试药 磷酸，AR级，天津市富宇精细化工有限公司；水，自制；柠檬酸(批号111679-200401)对照品，购自中国食品药品检定研究院；桑椹药材：安徽产地(批号20150412、20150415)，新疆药材(批号20150418、20150419、20150421)，较广产地批号(20150422)，河南产地(批号20150508)，江苏产地(批号20150428)，四川产地(批号20150502)，陕西产地(批号20150427)由陕西君碧莎制药有限公司提供。
2 实验方法
2.1色谱条件 色谱柱为Kromasil C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：0.6% 磷酸水溶液；检测波长：209 nm；流速：0.5 ml/min；柱温：30℃；进样量10 μl。
2.2对照品溶液的配制 精密称取柠檬酸对照品17.2 mg，置10 ml容量瓶，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，超声并摇匀，滤过，取续虑液，作为母液，备用。
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2.3供试品溶液的制备 取样品粉末(过4号筛)2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入蒸馏水100 ml，称定重量，加热回流提取1 h，放冷，再精密称定重量，用水补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.4标准曲线及线性范围 量取母液0.30，0.50，1.00，2.00， 4.00 ml，分别置于5 ml量瓶中，加蒸馏水溶解并定容至刻度，滤过，分别得到浓度为0.10320、0.17200、0.34400、0.68800、1.37600 mg/ml的对照品溶液，按上述条件测定峰面积，以对照品峰面积值(y)为纵坐标，柠檬酸浓度(x)为横坐标进行线性回归。结果：柠檬酸的质量浓度范围(mg/ml)、线性方程及相关系数(r)分别为：线性范围为0.10320～1.72000 mg/ml，回归方程为y=1278680x+1614，r=0.9999。结果表明对照品在相应浓度范围内线性关系良好。
2.5精密度实验 精密量取线性样品溶液(浓度为1.72 mg/ml)1.07 ml于5 ml量瓶中加蒸馏水至定容至刻度，得浓度为0.36808 mg/ml，按上述色谱条件重复进样6次，测得柠檬酸峰面积值的RSD分别为1.01%。结果表明该方法精密度良好。
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2.6稳定性实验 取精密度试验样品溶液(浓度为0.36808 mg/ml)，每间隔一定时间进样一次，测定柠檬酸对照品峰面积的RSD值分别为2.28%。结果表明柠檬酸对照品峰面积值在8 h内稳定。
2.7加样回收实验 采用加样回收法，取已测知含量的样品(江苏产，批号20150428，含量为5.140%)，精密称取柠檬酸对照品50.00 mg加入其中。按供试品溶液制备法操作，并按上述色谱条件进行测定，计算回收率。柠檬酸平均加样回收率为98.29%，结果表明本方法具有良好的回收率。
2.8重复性实验 精密称取样品(江苏产，批号20150428，含量5.140%)2.0000 g，按照供试品方法制备6份样品，按上述色谱条件进样测定，结果柠檬酸含量的RSD值分别为0.63%。结果表明本方法稳定。
2.9不同产地桑椹药材中柠檬酸含量的测定 分别精密量取供试品溶液10 μl，按前述色谱条件进样，测定峰面积，在此检测条件下，柠檬酸能够很好地分离。
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3 实验结果
3.1色谱图 柠檬酸对照品色谱图与供试品色谱图，见图1、图2。
3.2 桑椹中柠檬酸的测定结果，见表1。
4 讨论
4.1流动相的选择 实验中考察了1.0%醋酸与0.6%磷酸2种系统梯度洗脱及其不同流动相比例，比较的磷酸浓度有0.1%，0.3%，0.6%，1.0%水溶液。结果表明，各种流动相中0.6%磷酸水溶液系统为最佳，其图谱上各个色谱峰的分离度较好，保留时间适中，因此选此流动相系统作为桑椹药材中柠檬酸含量指标检测的流动相。
4.2制样方法 比较了用水作为溶剂超声提取与用水作为溶剂加热回流提取。结果表明，用水作为溶剂加热回流提取得到的峰面积较大、峰个数较多、分离度较好，所以选择用加热回流的方式提取。
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4.3其他 比较了不同柱温与流速，柱温超过30℃分析时间缩短，但大多数色谱峰分离度小或不能分开；流速<0.5 ml/min分析时间过长，>0.5 ml/min大多数色谱峰分离度差。因此选择便于控制的柱温30℃与流速 0.5 ml/min作为色谱条件。
综上所述，通过测定不同产地桑椹药材中柠檬酸成分含量的研究，表明该方法稳定可靠，单用液相色谱仪即可，避开了液相色谱与质谱连用的限制，使检测简单化。由于桑椹药材中的柠檬酸含量较高，且作用广泛，可用于桑椹药材的质量控制。
参考文献：
[1]施青红，王向阳.桑椹的功能成分及药理作用[J].专论与综述，2007，23(07)：153-154.
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[5]郑俊民.药用辅料手册[M].北京：化学工业出版社，2004：184-187.
[6]乐伟波，龚德华.枸橼酸的代谢动力学及其在连续性血液净化中的应用[J].医学继续教育，2009，18(4)：363-366.
[7]汪多仁.柠檬酸的开发与应用进展[J].精细化工原料及中间体，2011，20(9)：32-35.
编辑/翟辰万, http://www.100md.com(刘洋 肖会敏 何悦 史萌 刘海月 张俏 王四旺 唐志书)