槐角丸微生物限度检查方法验证研究
摘要：目的 建立槐角丸的微生物限度检查方法。方法 采用常规法和培养基稀释法进行计数方法验证，采用直接接种法进行控制菌检查方法验证。结果 可采用常规法进行霉菌和酵母菌总数测定，需采用培养基稀释法(0.2ml/皿)进行细菌总数测定，可采用直接接种法进行控制菌检查。
关键词：槐角丸；微生物限度检查；方法验证
槐角丸具有清肠疏风，凉血止血的功效。用于血热所致的肠风便血，痔疮肿痛。因其治疗效果确切，患者对其普遍认同，因而广泛用于临床。由于现行收载的检查项下，没有规定具体的微生物限度检查方法，为此对槐角丸按照《中国药典2010年版一部》进行微生物限度检查方法验证，从而有效地提高了微生物污染菌的检出率，保证了检查结果的有效性和可靠性。
1 仪器与材料
1.1仪器 MJ-Ⅱ型霉菌培养箱(上海一恒科技有限公司)；SPX-150型生化培养箱(上海金慧科电子有限公司)；SPX-250B-Z型生化培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)。
1.2试验菌 枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]。
1.3试验试材 营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、MUG培养基、乳糖胆盐发酵培养基、改良马丁培养基、氯化钠蛋白胨缓冲液，以上培养基均由北京陆桥技术有限公司提供。
稀释液：①0.9%无菌氯化钠溶液(用于菌液稀释)；②pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(用于供试品制备)。
1.4供试品 槐角丸批号150501，药品批准文号国药准字Z61021362，由陕西利君现代中药有限公司生产。
2 方法与结果
2.1菌液的制备 按照《中国药典2010年版一部》附录要求，采用10倍稀释法将5种阳性菌分别稀释至50～100cfu/ml的菌悬液，备用。
2.2供试液的制备 取供试品10g，加入到100ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，振摇使充分溶解，离心(500r/min，3min)，取上清液作为1：10供试液，备用。
2.3方法验证
2.3.1计数方法验证
2.3.1.1常规法 取供试液1ml和已制备好的5种阳性菌液分别1ml加入到培养皿中，加入金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的培养皿倾注15～20ml营养琼脂培养基，待凝固后，35℃培养3d，加入白色念珠菌、黑曲霉的培养皿倾注15～20ml玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后，25℃培养5d，作为试验组，同法测定所加的试验菌作为菌液组，测定供试品的本底菌作为供试品对照组，进行3次独立试验。采用平皿计数法，计算回收率：试验组菌回收率(%)=[(试验组菌数-供试品对照组菌数)/菌液组菌数]×100%，结果见表1。
结果白色念珠菌、黑曲霉的回收率>70%，表明霉菌和酵母菌可采用常规法进行检查，枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的回收率<70%，表明供试品对这两种细菌有一定程度的抑菌性，需采用培养基稀释法进行进一步的方法验证。
2.3.1.2 培养基稀释法 分别取供试液(0.5ml/皿)和(0.2ml/皿)，再分别加入试验菌金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌各50～100cfu/皿，同常规法进行试验，测定回收率。见表2。
由表2结果看，采用培养基稀释法(0.5ml/皿)，两种阳性菌的回收率仍小于70%，而采用培养基稀释法(0.2ml/皿)两种阳性菌的回收率均大于70%，表明可采用培养基稀释法(0.2ml/皿)对本供试品进行细菌总数测定。
2.3.2控制菌方法验证 直接接种法。
2.3.2.1大肠埃希菌 参照《中国药典2010年版一部》附录控制菌检查大肠埃希菌检查项下的方法进行试验，见表3。
2.3.2.2大肠菌群 参照《中国药典2010年版一部》附录控制菌检查大肠菌群检查项下的方法进行试验，见表4。
表3、表4试验结果表明，试验组和阳性对照组均分别检出大肠埃希菌和大肠菌群；阴性对照组均未检出试验菌。可采用直接接种法进行控制菌中大肠埃希菌和大肠菌群的检查。
3 讨论
本实验对槐角丸的微生物限度检查方法按照《中国药典2010年版一部》进行方法验证，结果可采用培养基稀释法(0.2ml/皿)进行细菌总数检查，可采用常规法进行霉菌和酵母菌计数，可采用直接接种法进行控制菌的检查。
本试验研究结果表明，槐角丸对细菌中金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌具有较强的的抑制作用，不能采用常规法直接对槐角丸进行细菌总数测定。槐角丸全方由槐角、地榆炭、黄芩、枳壳、当归、防风组成。由于槐角丸组成较为复杂，一些组成成分本身对微生物有不同程度的抑制作用[2]，具体哪种中药成分或者几种中药成分的共同抑菌作用还有待于进一步研究。
参考文献：
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2010：附录79-86.
[2]路俊仙，崔璐，等.不同种质黄芩体外抑菌作用的研究[J].现代药物与临床，2009(06).编辑/周芸霏, http://www.100md.com(郑敏路京 赵静)
关键词：槐角丸；微生物限度检查；方法验证
槐角丸具有清肠疏风，凉血止血的功效。用于血热所致的肠风便血，痔疮肿痛。因其治疗效果确切，患者对其普遍认同，因而广泛用于临床。由于现行收载的检查项下，没有规定具体的微生物限度检查方法，为此对槐角丸按照《中国药典2010年版一部》进行微生物限度检查方法验证，从而有效地提高了微生物污染菌的检出率，保证了检查结果的有效性和可靠性。
1 仪器与材料
1.1仪器 MJ-Ⅱ型霉菌培养箱(上海一恒科技有限公司)；SPX-150型生化培养箱(上海金慧科电子有限公司)；SPX-250B-Z型生化培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)。
1.2试验菌 枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]。
1.3试验试材 营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、MUG培养基、乳糖胆盐发酵培养基、改良马丁培养基、氯化钠蛋白胨缓冲液，以上培养基均由北京陆桥技术有限公司提供。
稀释液：①0.9%无菌氯化钠溶液(用于菌液稀释)；②pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(用于供试品制备)。
1.4供试品 槐角丸批号150501，药品批准文号国药准字Z61021362，由陕西利君现代中药有限公司生产。
2 方法与结果
2.1菌液的制备 按照《中国药典2010年版一部》附录要求，采用10倍稀释法将5种阳性菌分别稀释至50～100cfu/ml的菌悬液，备用。
2.2供试液的制备 取供试品10g，加入到100ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，振摇使充分溶解，离心(500r/min，3min)，取上清液作为1：10供试液，备用。
2.3方法验证
2.3.1计数方法验证
2.3.1.1常规法 取供试液1ml和已制备好的5种阳性菌液分别1ml加入到培养皿中，加入金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的培养皿倾注15～20ml营养琼脂培养基，待凝固后，35℃培养3d，加入白色念珠菌、黑曲霉的培养皿倾注15～20ml玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后，25℃培养5d，作为试验组，同法测定所加的试验菌作为菌液组，测定供试品的本底菌作为供试品对照组，进行3次独立试验。采用平皿计数法，计算回收率：试验组菌回收率(%)=[(试验组菌数-供试品对照组菌数)/菌液组菌数]×100%，结果见表1。
结果白色念珠菌、黑曲霉的回收率>70%，表明霉菌和酵母菌可采用常规法进行检查，枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的回收率<70%，表明供试品对这两种细菌有一定程度的抑菌性，需采用培养基稀释法进行进一步的方法验证。
2.3.1.2 培养基稀释法 分别取供试液(0.5ml/皿)和(0.2ml/皿)，再分别加入试验菌金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌各50～100cfu/皿，同常规法进行试验，测定回收率。见表2。
由表2结果看，采用培养基稀释法(0.5ml/皿)，两种阳性菌的回收率仍小于70%，而采用培养基稀释法(0.2ml/皿)两种阳性菌的回收率均大于70%，表明可采用培养基稀释法(0.2ml/皿)对本供试品进行细菌总数测定。
2.3.2控制菌方法验证 直接接种法。
2.3.2.1大肠埃希菌 参照《中国药典2010年版一部》附录控制菌检查大肠埃希菌检查项下的方法进行试验，见表3。
2.3.2.2大肠菌群 参照《中国药典2010年版一部》附录控制菌检查大肠菌群检查项下的方法进行试验，见表4。
表3、表4试验结果表明，试验组和阳性对照组均分别检出大肠埃希菌和大肠菌群；阴性对照组均未检出试验菌。可采用直接接种法进行控制菌中大肠埃希菌和大肠菌群的检查。
3 讨论
本实验对槐角丸的微生物限度检查方法按照《中国药典2010年版一部》进行方法验证，结果可采用培养基稀释法(0.2ml/皿)进行细菌总数检查，可采用常规法进行霉菌和酵母菌计数，可采用直接接种法进行控制菌的检查。
本试验研究结果表明，槐角丸对细菌中金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌具有较强的的抑制作用，不能采用常规法直接对槐角丸进行细菌总数测定。槐角丸全方由槐角、地榆炭、黄芩、枳壳、当归、防风组成。由于槐角丸组成较为复杂，一些组成成分本身对微生物有不同程度的抑制作用[2]，具体哪种中药成分或者几种中药成分的共同抑菌作用还有待于进一步研究。
参考文献：
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2010：附录79-86.
[2]路俊仙，崔璐，等.不同种质黄芩体外抑菌作用的研究[J].现代药物与临床，2009(06).编辑/周芸霏, http://www.100md.com(郑敏路京 赵静)