探讨MSCs作为携带PEDF基因载体的可行性研究
摘要：目的 本研究采用重组色素上皮源性因子腺病毒(Ad-PEDF)转染小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)后，评估MSCs作为携带PEDF基因载体的可行性。方法 Ad-PEDF在HEK293细胞中扩增，并纯化后。将其转染入MSCs(MSCs-PEDF)，用Western Blot和ELISA检测培养上清液中PEDF的表达。结果 用Western Blot检测细胞培养上清中的PEDF为阳性表达。ELISA检测培养上清中PEDF浓度为78.8±4.8 ng/ml。结论 MSCs可以作为使用PEDF基因治疗肿瘤的载体。
关键词：骨髓间充质干细胞；色素上皮衍生因子；基因治疗；抗血管生成
血管生成是肿瘤生长和转移的必要条件[1]，因此，抗血管生成治疗是肿瘤治疗的一个重要部分。色素上皮衍生因子(PEDF)是已知最强的内源性血管生成抑制因子，可通过抑制血管内皮细胞增殖、迁移及诱导其凋亡来发挥其抗血管生成作用[2]。重组PEDF蛋白以及病毒载体介导的PEDF基因治疗已应用于多个实验研究，并显示出治疗前景[4]。骨髓间充质干细胞(MSCs)作为一种新颖、有效的靶向肿瘤细胞的载体可能为提高PEDF的治疗效果提供一种新的策略[3]。本研究拟通过重组色素上皮源性因子腺病毒(Ad-PEDF)转染小鼠MSCs后，从而评估MSCs作为肿瘤基因治疗的载体的可行性。
1 资料与方法
1.1细胞培养
1.1.1 293细胞的培养 将293细胞置于含有10%FBS及100U/ml阿米卡星的DMEM培养基中，在37℃、5%CO2， 95%湿度条件下的孵箱中培养，以 0.25% 的胰蛋白酶消化，一般2～3d传代一次。
1.1.2人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的分离及培养 取产后新鲜脐带15～20cm，用血管钳夹紧脐带一端，从另一端注入0.1%的胶原酶消化。将收集的消化液体离心(1500转/min)3min。接种于培养瓶中，置于孵箱中培养。
1.1.3小鼠MSCs的分离、培养及鉴定取。6～8周龄C57BL/6雌性小鼠，处死后在无菌条件下取股骨和胫骨，离心后用含有10% FBS的DMEM培养基重悬细胞，并接种于方瓶中，置于孵箱中培养。
1.2 PEDF重组腺病毒载体(Ad-PEDF)的扩增与纯化
1.2.1 Ad-PEDF的扩增 将293细胞传代培养，当其密度达到90%时，加入适量病毒上清感染细胞。约2～3d后出现细胞病变，待细胞几乎变圆，且有一半细胞漂浮时，收集细胞上清液至离心管中，3000转/min，4℃，离心10min，将上清液用0.45μm滤器过滤，保存于-80℃。
1.2.2病毒纯化 使用Vira TrapTM Adenovirus Purification Maxiprep Kit 纯化病毒(具体步骤见说明书)。
1.2.3病毒滴度测定(TCID50法) 将293细胞以1×104个/孔接种于96孔板中，将病毒液按对数级稀释(10-5～10-10)，每个浓度设置10个复孔，连续观察10d后记录每个稀释度出现CPE(致细胞病变效应)的孔数，计算细胞病变率。如果某一浓度各孔细胞全部病变，比率为1，如无细胞病变，则比率为0。
1.3重组腺病毒体外感染MSCs 加入含有适量 Ad-PEDF 重组腺病毒低糖DMEM，感染复数(MOI)=1500，摇匀，置于孵育箱中培养4h后换液，48h后收集感染后MSCs。
1.4检测 MSCs-PEDF 中 PEDF蛋白的体外表达
1.4.1样品制备 加入Ad-PEDF的MSCs作为对照。收集各组的培养液上清，采用Western blot 体外表达的PEDF蛋白进行鉴定分析，采用ELISA测定培养上清中PEDF浓度，分别测定三组培养上清中的PEDF浓度。
1.5统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，实验所得数据采用(x±s)表示，多组间均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)；P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离培养和鉴定 MSCs的原代培养：原代细胞生长较慢，2w左右可长满瓶底，传代后细胞生长速度则明显加快，可得到较高纯度的MSCs。传代3次后，细胞形态较为一致，呈长梭形，多为平行排列生长或漩涡状生长。
2.2重组腺病毒验证及滴度测定 DNA电泳显示Ad-PEDF泳道在1200～1500bp之间出现一单一条带。说明扩增的腺病毒含有PEDF基因。
2.3 Ad-PEDF转染MSCs后重组PEDF的体外表达检测 转染了Ad-PEDF的MSCs(MSCs-PEDF)细胞裂解液及培养液上清在50KD处均出现一明显条带，说明MSCs-PEDF可表达重组PEDF并分泌至细胞外。ELISA检测结果表明，MSCs-PEDF培养上清中的PEDF浓度可78.8ng/ml，而MSCs-LacZ及MSCs则仅微量表达。
3 讨论
在本研究中，我们通过体外实验证明了携带有PEDF基因的MSCs在细胞裂解液及培养液中阳性表达PEDF。肿瘤进展依赖于新的血管网的生成以供给其营养[7]。血管生成在肿瘤的发生、发展及转移过程中都发挥着重要作用。如果能有效地阻止肿瘤的血管生成，就有望控制手术或放、化疗治疗后肿瘤的复发和转移。
PEDF最初是从胎儿视网膜色素上皮细胞中分离得到，而近年来，人们发现它有着强有力的抗血管生成活性[4]。PEDF可通过以下机制来实现其对血管生成的抑制作用：①抑制内皮细胞增殖和迁移以及形成小管；②通过Fas/FasL通路诱导内皮细胞凋亡；③下调促血管生成因子特别是VEGF的表达，从而打破促血管生成因子和抗血管生成因子之间的平衡[5]。以上的生理特性，奠定了PEDF应用于肿瘤治疗的基础。目前，已有大量的实验研究显示，PEDF可显著抑制肿瘤的生长和转移。纯化的重组蛋白在体内易于降解，纯化困难，价格较昂贵。而以病毒或非病毒为载体的基因治疗难以在肿瘤组织内达到较高的治疗浓度。这些缺点大大降低了它们潜在的治疗效果和应用价值。因此，如何将PEDF基因有效地运送到肿瘤部位，并使其在局部持续表达是本实验今后的研究重点。
参考文献：
[1]Ferlay J， Autier P， Boniol M， et al. Estimates of the cancer incidence and mortality in Europe in 2006 [J]. Ann Oncol， 2007， 18(3)：581-592.
[2]Ettinger DS， Akerley W， Bepler G， et al. Non-small cell lung cancer [J]. J Natl Compr Canc Netw， 2010， 8(7)：740-801.
[3]Jemal A， Siegel R， Ward E， et al.Cancer statistics 2009 [J]. CA Cancer J Clin， 2009， 59(4)：225-249.
[4]刘康，白亦光，陈竹，等. 兔骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定[J].川北医学院学报，2011(02)：103-106.
[5]王亚琴，刘钧. 肺针吸细胞病理学在肺部疾病诊断中的应用[J].川北医学院学报，2014(29)3： 222-224.
编辑/蔡睿琳, 百拇医药(陈巧玲 白亦光)
关键词：骨髓间充质干细胞；色素上皮衍生因子；基因治疗；抗血管生成
血管生成是肿瘤生长和转移的必要条件[1]，因此，抗血管生成治疗是肿瘤治疗的一个重要部分。色素上皮衍生因子(PEDF)是已知最强的内源性血管生成抑制因子，可通过抑制血管内皮细胞增殖、迁移及诱导其凋亡来发挥其抗血管生成作用[2]。重组PEDF蛋白以及病毒载体介导的PEDF基因治疗已应用于多个实验研究，并显示出治疗前景[4]。骨髓间充质干细胞(MSCs)作为一种新颖、有效的靶向肿瘤细胞的载体可能为提高PEDF的治疗效果提供一种新的策略[3]。本研究拟通过重组色素上皮源性因子腺病毒(Ad-PEDF)转染小鼠MSCs后，从而评估MSCs作为肿瘤基因治疗的载体的可行性。
1 资料与方法
1.1细胞培养
1.1.1 293细胞的培养 将293细胞置于含有10%FBS及100U/ml阿米卡星的DMEM培养基中，在37℃、5%CO2， 95%湿度条件下的孵箱中培养，以 0.25% 的胰蛋白酶消化，一般2～3d传代一次。
1.1.2人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的分离及培养 取产后新鲜脐带15～20cm，用血管钳夹紧脐带一端，从另一端注入0.1%的胶原酶消化。将收集的消化液体离心(1500转/min)3min。接种于培养瓶中，置于孵箱中培养。
1.1.3小鼠MSCs的分离、培养及鉴定取。6～8周龄C57BL/6雌性小鼠，处死后在无菌条件下取股骨和胫骨，离心后用含有10% FBS的DMEM培养基重悬细胞，并接种于方瓶中，置于孵箱中培养。
1.2 PEDF重组腺病毒载体(Ad-PEDF)的扩增与纯化
1.2.1 Ad-PEDF的扩增 将293细胞传代培养，当其密度达到90%时，加入适量病毒上清感染细胞。约2～3d后出现细胞病变，待细胞几乎变圆，且有一半细胞漂浮时，收集细胞上清液至离心管中，3000转/min，4℃，离心10min，将上清液用0.45μm滤器过滤，保存于-80℃。
1.2.2病毒纯化 使用Vira TrapTM Adenovirus Purification Maxiprep Kit 纯化病毒(具体步骤见说明书)。
1.2.3病毒滴度测定(TCID50法) 将293细胞以1×104个/孔接种于96孔板中，将病毒液按对数级稀释(10-5～10-10)，每个浓度设置10个复孔，连续观察10d后记录每个稀释度出现CPE(致细胞病变效应)的孔数，计算细胞病变率。如果某一浓度各孔细胞全部病变，比率为1，如无细胞病变，则比率为0。
1.3重组腺病毒体外感染MSCs 加入含有适量 Ad-PEDF 重组腺病毒低糖DMEM，感染复数(MOI)=1500，摇匀，置于孵育箱中培养4h后换液，48h后收集感染后MSCs。
1.4检测 MSCs-PEDF 中 PEDF蛋白的体外表达
1.4.1样品制备 加入Ad-PEDF的MSCs作为对照。收集各组的培养液上清，采用Western blot 体外表达的PEDF蛋白进行鉴定分析，采用ELISA测定培养上清中PEDF浓度，分别测定三组培养上清中的PEDF浓度。
1.5统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，实验所得数据采用(x±s)表示，多组间均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)；P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离培养和鉴定 MSCs的原代培养：原代细胞生长较慢，2w左右可长满瓶底，传代后细胞生长速度则明显加快，可得到较高纯度的MSCs。传代3次后，细胞形态较为一致，呈长梭形，多为平行排列生长或漩涡状生长。
2.2重组腺病毒验证及滴度测定 DNA电泳显示Ad-PEDF泳道在1200～1500bp之间出现一单一条带。说明扩增的腺病毒含有PEDF基因。
2.3 Ad-PEDF转染MSCs后重组PEDF的体外表达检测 转染了Ad-PEDF的MSCs(MSCs-PEDF)细胞裂解液及培养液上清在50KD处均出现一明显条带，说明MSCs-PEDF可表达重组PEDF并分泌至细胞外。ELISA检测结果表明，MSCs-PEDF培养上清中的PEDF浓度可78.8ng/ml，而MSCs-LacZ及MSCs则仅微量表达。
3 讨论
在本研究中，我们通过体外实验证明了携带有PEDF基因的MSCs在细胞裂解液及培养液中阳性表达PEDF。肿瘤进展依赖于新的血管网的生成以供给其营养[7]。血管生成在肿瘤的发生、发展及转移过程中都发挥着重要作用。如果能有效地阻止肿瘤的血管生成，就有望控制手术或放、化疗治疗后肿瘤的复发和转移。
PEDF最初是从胎儿视网膜色素上皮细胞中分离得到，而近年来，人们发现它有着强有力的抗血管生成活性[4]。PEDF可通过以下机制来实现其对血管生成的抑制作用：①抑制内皮细胞增殖和迁移以及形成小管；②通过Fas/FasL通路诱导内皮细胞凋亡；③下调促血管生成因子特别是VEGF的表达，从而打破促血管生成因子和抗血管生成因子之间的平衡[5]。以上的生理特性，奠定了PEDF应用于肿瘤治疗的基础。目前，已有大量的实验研究显示，PEDF可显著抑制肿瘤的生长和转移。纯化的重组蛋白在体内易于降解，纯化困难，价格较昂贵。而以病毒或非病毒为载体的基因治疗难以在肿瘤组织内达到较高的治疗浓度。这些缺点大大降低了它们潜在的治疗效果和应用价值。因此，如何将PEDF基因有效地运送到肿瘤部位，并使其在局部持续表达是本实验今后的研究重点。
参考文献：
[1]Ferlay J， Autier P， Boniol M， et al. Estimates of the cancer incidence and mortality in Europe in 2006 [J]. Ann Oncol， 2007， 18(3)：581-592.
[2]Ettinger DS， Akerley W， Bepler G， et al. Non-small cell lung cancer [J]. J Natl Compr Canc Netw， 2010， 8(7)：740-801.
[3]Jemal A， Siegel R， Ward E， et al.Cancer statistics 2009 [J]. CA Cancer J Clin， 2009， 59(4)：225-249.
[4]刘康，白亦光，陈竹，等. 兔骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定[J].川北医学院学报，2011(02)：103-106.
[5]王亚琴，刘钧. 肺针吸细胞病理学在肺部疾病诊断中的应用[J].川北医学院学报，2014(29)3： 222-224.
编辑/蔡睿琳, 百拇医药(陈巧玲 白亦光)