HPLC法测定阿昔洛韦眼用凝胶中阿昔洛韦含量
摘要：目的 通过HPLC方法测定阿昔洛韦在阿昔洛韦眼用凝胶中的含量。方法 在色谱条件：ZorbaxExtendC18不锈钢柱(250 mm×4 mm，5 μm)为色谱柱，流动相：水-甲醇-冰醋酸(90∶10∶0.1)，检测波长：252 nm，进样量10 μ，1.0 mL/min流速，柱温为室温(25℃)条件下进行检测。结果 阿昔洛韦在0.12～1.44 ug/mL范围内线性关系良好，线性方程为：Y=633417X-52341(r=0.9996)，平均回收率为100.67%，RSD为1.32%。结论 采用高效液相色谱方法，可有效评估阿昔洛韦眼用凝胶中阿昔洛韦的含量，本法结果准确、方法简单、灵敏度高。
关键词：HPLC法；阿昔洛韦；眼用凝胶；含量
单纯疱疹病毒性角膜炎又称单疱角膜炎，是由单纯疱疹病毒诱发的角膜感染引起的一类眼科疾病，是目前世界上危害最为严重的眼科疾病之一[1]，阿昔洛韦(aciclovior)因其选择性高、副作用小、药物耐受好且为高特异性抗单纯疱疹病毒药物，成为目前单疱角膜炎最佳治疗药物。早期眼部用药治疗多采用眼膏或滴眼剂，因使用方便、患者接受性好等特点，被广泛应用，但近期研究发现，由于滴眼剂在眼内停留时间较多，且容易被体内吸收，药物生物利用率低，重复多次应用又可能引发较多副作用[2]。凝胶型眼用制剂的出现，有效解决了上述问题。阿昔洛韦凝胶剂可有效解决单疱角膜炎治疗需反复用药、生物利用率低等问题。如何快速测定此类眼用凝胶中主成分含量，有效监测此类药物质量，成为众多药学所关注的问题。
1 材料与方法
1.1仪器与试药 岛津LC-20A型高效液相色谱仪；离心机(北京医用离心机厂)；甲醇、冰醋酸均由国药集团化学试剂有限公司提供，均为色谱醇；阿昔洛韦对照品(中国药品生物制品检定所，批号：150913-151102)；阿昔洛韦凝胶(江苏圣宝罗药业有限公司，国药准字H19991377，批号为：140911、150212、150622)。
1.2方法
1.2.1方法学验证
1.2.1.1色谱条件 色谱柱：ZorbaxExtendC18不锈钢柱(250 mm×4 mm，5 μm)，流动相：水-甲醇-冰醋酸(90∶10∶0.1)，检测波长：252nm，进样量10 μl，1.0 mL/min流速，柱温为室温(25℃)。
1.2.1.2溶液的制备
1.2.1.2.1供试品溶液的制备 精密称取0.3 g阿昔洛韦凝胶，加入流动相25 ml稀释，充分混匀后，于3000 r/min，离心5 min，取上清液，0.2 um微孔滤膜过滤，取续滤液做供试液。
1.2.1.2.2对照溶液的制备 精密量取阿昔洛韦对照品15 mg，置于100 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀即得。
1.2.1.3系统适用性试验
1.2.1.3.1空白对照结果 试验中的空白溶剂选择为流动相，取流动相适量，除不加样品外其余操作同“1.2.1.2.1”制备空白对照，取10 ul进液相252 nm扫描，未见任何杂质峰，对测定不会造成影响，可考虑作为空白溶剂。
1.2.1.3.2精密度试验 精密量取20 μL对照品溶液，重复进样6次，分别测定峰面积，并计算其相对标准偏差RSD=1.2%(<2.0%)，符合标准规定，结果表明本实验精密度良好。
1.2.1.3.3重复性试验 精密称取同批号阿昔洛韦凝胶6份，根据供试品“1.2.1.2.1”项操作制备溶液，取10 μL溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，可得到6份供试品溶液的相对标准偏差RSD=0.9%(<2.0%)，符合标准规定，因此具有良好的重复性。
1.2.1.3.4稳定性试验 取供试品溶液与对照品溶液，分别在0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h精密量取10 μL注入液相色谱仪，进样测定，对照品溶液峰面积的RSD为1.16%(<2.0%)，符合标准规定；供试品溶液峰面积RSD为1.23%(<2.0%)，符合标准规定，提示对照品及供试品溶液在48 h内稳定。
1.2.1.3.5回收率考察 分别精密称取约10 mg同一批次的阿昔洛韦凝胶，保存至3个锥形瓶内，依次加阿昔洛韦对照品2.23 mg、5.17和10.31 mg，根据制作“1.2.1.2.1”项步骤，取续滤液10 ul进针，对峰面积进行测定，分别计算回收率为101.23%、101.18%和99.79%，平均回收率为100.67%，RSD为1.32%，与药典标准相符。
1.2.1.4线性关系考察 精密称取阿昔洛韦对照品13.4 mg置于100 ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，再分别精密量取0.05 ml、0.10 ml、0.20 ml、0.40 ml、0.80 ml、1 ml、2 ml、5 ml、6 ml置于10 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得系列标准溶液，分别取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，并以峰面积对其浓度进行线性回归，得线性方程为：Y=633417X-52341，(r=0.9996)，结果表明，阿昔洛韦浓度在0.12～1.44 ug/mL范围内与峰面积线性关系良好。
1.2.2样品中阿昔洛韦含量测定 在同一色谱条件下分别测定阿昔洛韦对照品溶液与3批阿昔洛韦凝胶供试品溶液(取供试品0.2 g)，采用峰面积归一化法和自身对照法(不加校正因子)，对供试品内含有的阿昔洛韦含量进行测定。
2 结果
结果显示，通过上述色谱条件测定阿昔洛韦凝胶中阿昔洛韦含量，与标识量比较结果显示，三个批次的样本含量分别为101.23%、100.49%、100.37%，RSD<2%，见表1。
3 讨论
阿昔洛韦(C8H11N5O3)属嘌呤类抗病毒药物[3]，本文首先通过对其进行全波段扫描，确定252 nm作为其检测波长，因此时吸收最大；前期试验及文献调查显示，凝胶中存在大分子物质，可能导致色谱柱堵塞，进而影响测定，经试验分析在酸性流动相处理后，对应高聚物配合离心可有效去除，故考虑先对样品稀释后离心，排除干扰；在色谱条件选择上，本文参考了早期[4]的文献报道，结合本实验室条件优选所得。
经方法学考察可知，本次实验所选方法准确性高、精密度好、重现性和相关性均符合相关要求，且比较自身对照法和面积归一化法，发现两组结果基本一致，提示二者均可用于其含量计算。
参考文献：
[1]胡汉昆，吴东方，刘薇芝.高效液相色谱法测定阿昔洛韦眼凝胶中阿昔洛韦的含量[J].HeraldofMedicine，2010，29(12)：1644-1645.
[2]谢爱丽，王维.HPLC法测定阿昔洛韦乳膏(Ⅱ)中阿昔洛韦的含量[J].海峡药学，2013，25(4)：41-42.
[3]王书玉，王磊，窦佳，等.离心分配色谱法测定阿昔洛韦乳膏中主成分的含量[J].中国药房，2015(18)：2567-2569.
[4]刘海宏，李振武，李宏斌，等.高效液相色谱法测定阿昔洛韦眼用凝胶中阿昔洛韦含量[J].中国药业，2011，20(9)：22-23.
编辑/肖慧, 百拇医药(林永炼)
关键词：HPLC法；阿昔洛韦；眼用凝胶；含量
单纯疱疹病毒性角膜炎又称单疱角膜炎，是由单纯疱疹病毒诱发的角膜感染引起的一类眼科疾病，是目前世界上危害最为严重的眼科疾病之一[1]，阿昔洛韦(aciclovior)因其选择性高、副作用小、药物耐受好且为高特异性抗单纯疱疹病毒药物，成为目前单疱角膜炎最佳治疗药物。早期眼部用药治疗多采用眼膏或滴眼剂，因使用方便、患者接受性好等特点，被广泛应用，但近期研究发现，由于滴眼剂在眼内停留时间较多，且容易被体内吸收，药物生物利用率低，重复多次应用又可能引发较多副作用[2]。凝胶型眼用制剂的出现，有效解决了上述问题。阿昔洛韦凝胶剂可有效解决单疱角膜炎治疗需反复用药、生物利用率低等问题。如何快速测定此类眼用凝胶中主成分含量，有效监测此类药物质量，成为众多药学所关注的问题。
1 材料与方法
1.1仪器与试药 岛津LC-20A型高效液相色谱仪；离心机(北京医用离心机厂)；甲醇、冰醋酸均由国药集团化学试剂有限公司提供，均为色谱醇；阿昔洛韦对照品(中国药品生物制品检定所，批号：150913-151102)；阿昔洛韦凝胶(江苏圣宝罗药业有限公司，国药准字H19991377，批号为：140911、150212、150622)。
1.2方法
1.2.1方法学验证
1.2.1.1色谱条件 色谱柱：ZorbaxExtendC18不锈钢柱(250 mm×4 mm，5 μm)，流动相：水-甲醇-冰醋酸(90∶10∶0.1)，检测波长：252nm，进样量10 μl，1.0 mL/min流速，柱温为室温(25℃)。
1.2.1.2溶液的制备
1.2.1.2.1供试品溶液的制备 精密称取0.3 g阿昔洛韦凝胶，加入流动相25 ml稀释，充分混匀后，于3000 r/min，离心5 min，取上清液，0.2 um微孔滤膜过滤，取续滤液做供试液。
1.2.1.2.2对照溶液的制备 精密量取阿昔洛韦对照品15 mg，置于100 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀即得。
1.2.1.3系统适用性试验
1.2.1.3.1空白对照结果 试验中的空白溶剂选择为流动相，取流动相适量，除不加样品外其余操作同“1.2.1.2.1”制备空白对照，取10 ul进液相252 nm扫描，未见任何杂质峰，对测定不会造成影响，可考虑作为空白溶剂。
1.2.1.3.2精密度试验 精密量取20 μL对照品溶液，重复进样6次，分别测定峰面积，并计算其相对标准偏差RSD=1.2%(<2.0%)，符合标准规定，结果表明本实验精密度良好。
1.2.1.3.3重复性试验 精密称取同批号阿昔洛韦凝胶6份，根据供试品“1.2.1.2.1”项操作制备溶液，取10 μL溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，可得到6份供试品溶液的相对标准偏差RSD=0.9%(<2.0%)，符合标准规定，因此具有良好的重复性。
1.2.1.3.4稳定性试验 取供试品溶液与对照品溶液，分别在0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h精密量取10 μL注入液相色谱仪，进样测定，对照品溶液峰面积的RSD为1.16%(<2.0%)，符合标准规定；供试品溶液峰面积RSD为1.23%(<2.0%)，符合标准规定，提示对照品及供试品溶液在48 h内稳定。
1.2.1.3.5回收率考察 分别精密称取约10 mg同一批次的阿昔洛韦凝胶，保存至3个锥形瓶内，依次加阿昔洛韦对照品2.23 mg、5.17和10.31 mg，根据制作“1.2.1.2.1”项步骤，取续滤液10 ul进针，对峰面积进行测定，分别计算回收率为101.23%、101.18%和99.79%，平均回收率为100.67%，RSD为1.32%，与药典标准相符。
1.2.1.4线性关系考察 精密称取阿昔洛韦对照品13.4 mg置于100 ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，再分别精密量取0.05 ml、0.10 ml、0.20 ml、0.40 ml、0.80 ml、1 ml、2 ml、5 ml、6 ml置于10 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得系列标准溶液，分别取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，并以峰面积对其浓度进行线性回归，得线性方程为：Y=633417X-52341，(r=0.9996)，结果表明，阿昔洛韦浓度在0.12～1.44 ug/mL范围内与峰面积线性关系良好。
1.2.2样品中阿昔洛韦含量测定 在同一色谱条件下分别测定阿昔洛韦对照品溶液与3批阿昔洛韦凝胶供试品溶液(取供试品0.2 g)，采用峰面积归一化法和自身对照法(不加校正因子)，对供试品内含有的阿昔洛韦含量进行测定。
2 结果
结果显示，通过上述色谱条件测定阿昔洛韦凝胶中阿昔洛韦含量，与标识量比较结果显示，三个批次的样本含量分别为101.23%、100.49%、100.37%，RSD<2%，见表1。
3 讨论
阿昔洛韦(C8H11N5O3)属嘌呤类抗病毒药物[3]，本文首先通过对其进行全波段扫描，确定252 nm作为其检测波长，因此时吸收最大；前期试验及文献调查显示，凝胶中存在大分子物质，可能导致色谱柱堵塞，进而影响测定，经试验分析在酸性流动相处理后，对应高聚物配合离心可有效去除，故考虑先对样品稀释后离心，排除干扰；在色谱条件选择上，本文参考了早期[4]的文献报道，结合本实验室条件优选所得。
经方法学考察可知，本次实验所选方法准确性高、精密度好、重现性和相关性均符合相关要求，且比较自身对照法和面积归一化法，发现两组结果基本一致，提示二者均可用于其含量计算。
参考文献：
[1]胡汉昆，吴东方，刘薇芝.高效液相色谱法测定阿昔洛韦眼凝胶中阿昔洛韦的含量[J].HeraldofMedicine，2010，29(12)：1644-1645.
[2]谢爱丽，王维.HPLC法测定阿昔洛韦乳膏(Ⅱ)中阿昔洛韦的含量[J].海峡药学，2013，25(4)：41-42.
[3]王书玉，王磊，窦佳，等.离心分配色谱法测定阿昔洛韦乳膏中主成分的含量[J].中国药房，2015(18)：2567-2569.
[4]刘海宏，李振武，李宏斌，等.高效液相色谱法测定阿昔洛韦眼用凝胶中阿昔洛韦含量[J].中国药业，2011，20(9)：22-23.
编辑/肖慧, 百拇医药(林永炼)