人类microRNA—1246慢病毒抑制载体的构建以及鉴定(3)
1.2.7慢病毒感染siha细胞 感染前先做预实验检测siha细胞的moi值，感染前1 d将siha细胞以5×104/ml的密度接种于24孔板(细胞融合率为30%～40%)，分为3个组，分别为空白组、阴性对照组、mir-1246down，感染前1 h换成Enhance Infection Solution，然后按预实验所得moi值加入病毒量及polybrene，8 h后换成有血清培养基，分别于24 h、48 h、72 h在荧光显微镜下观察细胞荧光表达量。
1.2.8 siha细胞稳转株的筛选；慢病毒感染siha细胞72 h后当细胞长满到90%以上，将细胞用胰酶消化，离心，(预实验检测得嘌呤霉素筛选的最适浓度为2 ug/ml)用含有2 ug/ml嘌呤霉素的培养基制成悬浊液种到6孔板中，每天用2 ug/ml嘌呤霉素的培养基换液。
1.2.9细胞增殖实验 将长到80%生长对数期的细胞消化收集种于96孔板，每孔细胞约3000个/100ul，每组设2平行组，各3个复孔，种2个板。接种后48 h起开始消化收集细胞进行计数，每隔24 h一次，连续6 d。消化下来的细胞加入台盼蓝，盼蓝拒染法进行细胞计数，绘制生长曲线。
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1.3统计学分析处理 数据采用 SPSS 16.0 软件分析，多组均数间的比较采用方差分析 F 检验，组间两两比较采用 q 检验，P<0.05 为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1酶切鉴定结果， AgeⅠ/EcoRⅠ分别酶切GV369及GV280
，1%琼脂凝胶电泳，紫外线下可见2个DNA片段，与理论计算片段一致。见图1。
2.2菌落PCR结果 对LB培养板上的菌落进行PCR筛选鉴定，可见多数菌落均为阳性克隆(图1)，抑制载体酶切产物分别为阳性转化子PCR产物大小：271bp。
2.3载体测序结果 载体经测序证实结果符合预期，插入目的基因片段与线性载体连接正确，符合设计要求，未见碱基缺失或突变等异常，证实已成功构建此两类载体，借助Vector NT软件，将序列导入。绘制质粒GV280-mir1246-down结构图。
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2.4基因转导效率的检测结果 用重组慢病毒介导GV280-mir-1246down转导入宫颈鳞癌siha细胞，重组病毒感染siha细胞48h后，将六孔板板放在显微镜下，可见到几乎100%的活细胞表达GFP见图3。
2.5 siha细胞稳转株，用嘌呤霉素筛选后anti-miR-1246-LV，病毒转染率几乎为100%。
2.6细胞增殖实验结果 我们发现通过感染anti-miR-1246病毒下调miR-1246的表达能够明显抑制宫颈癌细胞的增殖，P<0.01，差异有统计学意义。这说明miR-1246在促进宫颈癌细胞生长方面起到一定作用。
3讨论
最近的研究表明microRNA参与生理或疾病状态的调节，其中包括细胞死亡或凋亡，肿瘤的发生、发展、发育以及炎症反应等[5]。为了更为深入地阐明microRNA的作用机制，microRNA的功能学研究是不可或缺的。MicroRNA过表达或抑制表达的功能学可以采用很多方法，其中主要包括运用体外合成的mi-croRNA化学模拟物和抑制物或构建相关载体进行转染[6]。针对宫颈鳞癌siha细胞分裂增殖性能差及其真核载体转染率低下的特点，本研究在以往实验的基础上构建了相关microRNA的慢病毒载体，为下一步载体的包装及假病毒颗粒的制备做好准备。慢病毒载体是体内体外基因转染的有力工具，该系统往往由3部分组成，即携带目的基因的载体质粒。提供病毒结构部件(gag/pol)质粒以及提供病毒衣壳的质粒构成[7]。其主要有以下优势。首先，慢病毒不仅能够转染分裂期细胞，而且对分裂较慢的细胞甚至非分裂期的终末分化细胞具有同样的转染作用；其次，慢病毒所携带的目的基因更能够耐受转录沉默；最后，慢病毒能适合各种普遍的或组织特异的转录启动子，而且慢病毒自我失活的修饰在不降低病毒的滴度的情况下能使目的基因的表达在靶细胞内受内源性启动子单独的调控[8]。
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本研究采用的GV280质粒，来源于HIV-1构件，所构建的载体中携带的目的基因在EMCV IRES的下游，具有EGFP荧光蛋白基因，能为目的基因的表达提供可靠的保证[9]。MicroRNA过表达载体的构建可以采用microRNA的前体序列作为目的基因插入载体，也有研究采用的是包含microRNA前体序列两端的侧翼序列在内的核苷酸并经基因组DNA扩增后作为目的基因插入[10]。一般情况下当细胞内microRNA高水平表达时采用反义寡核苷酸抑制其活性来下调其表达水平是目前比较理想的loss-of-fuction研究手段。
本实验结果显示，成功构建了慢病毒microRNA过表达表达质粒GV280-mir-1246down，具有极高的转染效果，几乎可以使100%的靶细胞获得目的基因，因为它带有GFP，可以通过荧光显微镜观察有无绿色荧光GFP来了解靶细胞是否被转导了目的基因，而无需繁琐的免疫组化或者PCR方法验证，简化了实验过程，目的基因可在2～3 d内转导入100%的靶细胞，达到稳定表达。为转基因的研究提供了快速、有效的工具，同时也为基因治疗提供了有力的依据。细胞增殖实验显示，MiR-1246的下调可以抑制宫颈癌siha细胞的增殖能力，MiR-1246是宫颈鳞状上皮癌的致癌基因，它的下调表达可以明显的抑制宫颈癌细胞的增殖。
参考文献：
[1]Ambros， V.The functions of animal microRNAs[J].Nature，2004， 431(7006)： 350-355.
[2]Banno， K.MicroRNAs in endometrial cancer[J].Int J Clin Oncol，2013. 18(2)： 186-192., 百拇医药(赖月华 姚德生 杜萍 卢艳)
1.2.8 siha细胞稳转株的筛选；慢病毒感染siha细胞72 h后当细胞长满到90%以上，将细胞用胰酶消化，离心，(预实验检测得嘌呤霉素筛选的最适浓度为2 ug/ml)用含有2 ug/ml嘌呤霉素的培养基制成悬浊液种到6孔板中，每天用2 ug/ml嘌呤霉素的培养基换液。
1.2.9细胞增殖实验 将长到80%生长对数期的细胞消化收集种于96孔板，每孔细胞约3000个/100ul，每组设2平行组，各3个复孔，种2个板。接种后48 h起开始消化收集细胞进行计数，每隔24 h一次，连续6 d。消化下来的细胞加入台盼蓝，盼蓝拒染法进行细胞计数，绘制生长曲线。
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1.3统计学分析处理 数据采用 SPSS 16.0 软件分析，多组均数间的比较采用方差分析 F 检验，组间两两比较采用 q 检验，P<0.05 为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1酶切鉴定结果， AgeⅠ/EcoRⅠ分别酶切GV369及GV280
，1%琼脂凝胶电泳，紫外线下可见2个DNA片段，与理论计算片段一致。见图1。
2.2菌落PCR结果 对LB培养板上的菌落进行PCR筛选鉴定，可见多数菌落均为阳性克隆(图1)，抑制载体酶切产物分别为阳性转化子PCR产物大小：271bp。
2.3载体测序结果 载体经测序证实结果符合预期，插入目的基因片段与线性载体连接正确，符合设计要求，未见碱基缺失或突变等异常，证实已成功构建此两类载体，借助Vector NT软件，将序列导入。绘制质粒GV280-mir1246-down结构图。
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2.4基因转导效率的检测结果 用重组慢病毒介导GV280-mir-1246down转导入宫颈鳞癌siha细胞，重组病毒感染siha细胞48h后，将六孔板板放在显微镜下，可见到几乎100%的活细胞表达GFP见图3。
2.5 siha细胞稳转株，用嘌呤霉素筛选后anti-miR-1246-LV，病毒转染率几乎为100%。
2.6细胞增殖实验结果 我们发现通过感染anti-miR-1246病毒下调miR-1246的表达能够明显抑制宫颈癌细胞的增殖，P<0.01，差异有统计学意义。这说明miR-1246在促进宫颈癌细胞生长方面起到一定作用。
3讨论
最近的研究表明microRNA参与生理或疾病状态的调节，其中包括细胞死亡或凋亡，肿瘤的发生、发展、发育以及炎症反应等[5]。为了更为深入地阐明microRNA的作用机制，microRNA的功能学研究是不可或缺的。MicroRNA过表达或抑制表达的功能学可以采用很多方法，其中主要包括运用体外合成的mi-croRNA化学模拟物和抑制物或构建相关载体进行转染[6]。针对宫颈鳞癌siha细胞分裂增殖性能差及其真核载体转染率低下的特点，本研究在以往实验的基础上构建了相关microRNA的慢病毒载体，为下一步载体的包装及假病毒颗粒的制备做好准备。慢病毒载体是体内体外基因转染的有力工具，该系统往往由3部分组成，即携带目的基因的载体质粒。提供病毒结构部件(gag/pol)质粒以及提供病毒衣壳的质粒构成[7]。其主要有以下优势。首先，慢病毒不仅能够转染分裂期细胞，而且对分裂较慢的细胞甚至非分裂期的终末分化细胞具有同样的转染作用；其次，慢病毒所携带的目的基因更能够耐受转录沉默；最后，慢病毒能适合各种普遍的或组织特异的转录启动子，而且慢病毒自我失活的修饰在不降低病毒的滴度的情况下能使目的基因的表达在靶细胞内受内源性启动子单独的调控[8]。
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本研究采用的GV280质粒，来源于HIV-1构件，所构建的载体中携带的目的基因在EMCV IRES的下游，具有EGFP荧光蛋白基因，能为目的基因的表达提供可靠的保证[9]。MicroRNA过表达载体的构建可以采用microRNA的前体序列作为目的基因插入载体，也有研究采用的是包含microRNA前体序列两端的侧翼序列在内的核苷酸并经基因组DNA扩增后作为目的基因插入[10]。一般情况下当细胞内microRNA高水平表达时采用反义寡核苷酸抑制其活性来下调其表达水平是目前比较理想的loss-of-fuction研究手段。
本实验结果显示，成功构建了慢病毒microRNA过表达表达质粒GV280-mir-1246down，具有极高的转染效果，几乎可以使100%的靶细胞获得目的基因，因为它带有GFP，可以通过荧光显微镜观察有无绿色荧光GFP来了解靶细胞是否被转导了目的基因，而无需繁琐的免疫组化或者PCR方法验证，简化了实验过程，目的基因可在2～3 d内转导入100%的靶细胞，达到稳定表达。为转基因的研究提供了快速、有效的工具，同时也为基因治疗提供了有力的依据。细胞增殖实验显示，MiR-1246的下调可以抑制宫颈癌siha细胞的增殖能力，MiR-1246是宫颈鳞状上皮癌的致癌基因，它的下调表达可以明显的抑制宫颈癌细胞的增殖。
参考文献：
[1]Ambros， V.The functions of animal microRNAs[J].Nature，2004， 431(7006)： 350-355.
[2]Banno， K.MicroRNAs in endometrial cancer[J].Int J Clin Oncol，2013. 18(2)： 186-192., 百拇医药(赖月华 姚德生 杜萍 卢艳)