两种方法对产粘液型铜绿假单胞菌的药敏试验探讨
摘要：目的 通过两种方法对产粘液型铜绿假单胞菌的药敏试验进行分析和探讨。方法 应用纸片法来检测产粘液型铜绿假单胞菌的药敏试验，同时应用Vitek 2全自动化细菌鉴定药敏仪进行检测，比较两种方法的相关性。结果 158株产粘液型铜绿假单胞菌的药敏试验纸片法和仪器法大多数的药物还是存在显著性差异。结论 仪器法的结果还是不可靠，建议采用纸片法或其他MIC方法来检测产粘液型铜绿假单胞菌的药敏。
关键词：产粘液型铜绿假单胞菌；Vitek 2；全自动化细菌鉴定药敏仪；纸片
产粘液型铜绿假单胞菌是引起支气管炎、慢性支气管炎、支气管扩张并感染的重要病原菌之一。由于细菌的黏膜表面形成大量粘液-多糖藻酸盐等，从而持续定植、形成生物膜。慢性支气管炎急性发作患者的咯痰涂片可见铜绿假单胞菌形成大量微小的生物膜碎片，其周围有大量游离的裸菌。裸菌可刺激呼吸道黏膜造成感染性炎症[1]。由于临床分离到的产粘液型铜绿假单胞菌呈上升趋势，而我们用常规方法不易鉴定细菌和报告药敏试验，为此我们尝试采用了一种新型的肉汤稀释法与常规的药敏纸片法同时检测临床分离的158株菌株进行鉴定和药敏分析，现将结果报告如下：
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1 资料与方法
1.1一般资料
1.1.1菌株 来自临床分离的158株产粘液型铜绿假单胞菌。均来自痰标本，质控菌株大肠埃希氏菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853。
1.1.2试剂与仪器 哥伦比亚血琼脂和麦康凯、M-H琼脂购自伊华科技有限公司，氧化酶试剂和肉汤购自美国的Sigma公司，药敏纸片购自英国的Oxoi公司，Vitek 2全自动化细菌鉴定药敏仪购自法国生物梅里埃公司。
1.2方法
1.2.1菌株鉴定 大多数患者分离到的产粘液型铜绿假单胞菌在哥伦比亚血平板上35℃培养18～24 h，可见无色无味、露滴状、边缘不规则、不溶血的小菌落。48 h菌落融合为粘稠、胶冻样菌落，部分患者的菌株为淡绿色，溶血可有可无。在麦康凯平板上35℃培养18～24 h菌落为无色无味、粘稠、胶冻样、成片状的大菌落，用接种环不易挑起[2]。培养48 h部分患者菌株的菌落可有淡绿色或浅褐色。氧化酶试验均成阳性，这就可以初步区分下肺炎克雷伯菌(也会有粘液形成，但氧化酶阴性)。用无菌棉棒刮取在血平板上的产粘液型铜绿假单胞菌纯菌落加入营养肉汤中制作菌悬液，将菌悬液管反复颠倒振摇，置于35℃培养18～24 h，然后取上清液制成0.5麦氏单位菌悬液，用VITEK2的GN卡鉴定。
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1.2.2药敏试验 对分离到的158株产粘液型铜绿假单胞菌纸片扩散法在M-H上进行药敏试验，判断标准按照CLSI M100-S24标准执行。同时在VITEK2 上用配套的AST-GN13药敏卡严格按照仪器使用说明书进行药敏测定。
2 结果和分析
2.1两种方法检测158株产粘液型铜绿假单胞菌的药敏结果，见表1。
2.2两种方法的检测结果的统计学分析(SPSS)，见表2。
我们通过软件SPSS分析了各组的药敏结果，从表2中我们可以看到氨曲南、头孢吡肟、头孢他啶、庆大霉素、左氧氟沙星的P<0.05，说明有显著性差异。余下的阿米卡星、环丙沙星、亚胺培南、特治星、妥布霉素的P>0.05，说明无显著性差异。
3 讨论
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产粘液型铜绿假单胞菌自然存在的一种特殊形式，其在黏膜表面产生大量粘液--多糖藻酸盐等，从而持续定植、形成生物膜[3]。产粘液型铜绿假单胞菌在长期慢性呼吸道感染的患者痰标本中检出率高，准确及时的药敏结果更加重要。由于产粘液型铜绿假单胞菌的粘液使该菌生长明显减慢，一般都需要48 h才生长，并且在生理盐水中不容易形成均匀的菌悬液，使我们在上机鉴定和药敏试验时，无法鉴定或者结果不准确。故我们在转纯的时候采用哥伦比亚血琼脂，且生长良好。菌悬液的制备也是采用肉汤使其生长良好而容易鉴定。
我们在采取两种方法检测产粘液型铜绿假单胞菌的药敏时发现敏感组基本差异不大，P=0.649，说明两种方法的结果无差异。而在中介组，P=0.003，说明结果有显著差异。耐药组P=0.040，显示结果有显著差异。这些结果可以这样认为产粘液型铜绿假单胞菌，如果是机器检测药敏的话，结果不是很可靠，可能是生长不良的原因，有些耐药的结果变成中介了，至于敏感的菌株，不管你生长好或是不好，只要对照孔生长，机器肯定会出现敏感的结果，和纸片法应该是符合一致的，所以我们建议采用纸片法或者其他MIC法的方法来检测产粘液型铜绿假单胞菌的药敏。
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在我院分离到的产粘液型铜绿假单胞菌对10种常见的抗生素敏感性高，见表1，耐药性较弱，但在治疗产粘液型铜绿假单胞菌引起的感染时，往往临床反映效果不佳，我们应考虑藻酸盐对铜绿假单胞菌生物膜的形成的耐药性。如果由于生物被膜的作用而难以完全清除的话，就容易在体内寄居，这样就很容易诱发再次感染，而且反复的诱发以及反复的抗感染治疗，就容易导致耐药的形成，很强的定植和粘附能力，以及加上耐药的形成，一旦再次继发感染的话，治疗就更加困难。据小林宏行报道大环内酯类药物可通过抑制藻酸盐合成酶而减少细菌藻酸盐的分泌破坏细菌生物被膜的结构增加其他抗菌药物对细菌生物被膜渗透从而达到与其他抗菌药物联合杀菌的目的[4]。
体内的研究发现大环内酯类抗生素能使生物膜的表面形成孔穴，从而使生物膜内部细菌得以暴露，有利于敏感药物进入生物膜内部杀灭细菌。大环内酯类抗生素可使体内藻酸盐免疫复合物逐渐下降，可有效地抑制由藻酸盐介导的抗原抗体反应。大环内酯类抗生素尚有免疫调节作用，能有效地增强中性粒细胞对铜绿假单胞菌生物膜的吞噬作用；最新的研究发现克拉霉素能明显抑制铜绿假单胞菌菌毛的颤动从而抑制铜绿假单胞菌的致病力，总之，我们认为大环内酯类抗生素在治疗铜绿假单胞菌生物膜感染中具有举足轻重的作用，而这种作用是其他药物所不具备的[5]。
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参考文献：
[1]李彤，庄辉.细菌生物膜的研究进展[J].中华微生物学和免疫学杂志，2002，22(3)：343-346.
[2]周庭银，赵虎.临床微生物学诊断与图解[M].上海：上海科学技术出版社，2001：141.
[3]大垣宪隆，太田见宏，小林宏行.细菌感染症一最新化学疗法[J].临床微生物，1994，21(1)：51.
[4]小林宏行.细菌生物被膜的基础与临床[J].中国临床药理学杂志，1999，15：299-307.
[5]范春，牛其昌，王颖.铜绿假单胞菌生物膜耐药性机制及防治[J].国外医药抗生素分册，2004，25(5)：230-232.编辑/翟辰万, http://www.100md.com(陈慧萍 罗柳林 乐军)
关键词：产粘液型铜绿假单胞菌；Vitek 2；全自动化细菌鉴定药敏仪；纸片
产粘液型铜绿假单胞菌是引起支气管炎、慢性支气管炎、支气管扩张并感染的重要病原菌之一。由于细菌的黏膜表面形成大量粘液-多糖藻酸盐等，从而持续定植、形成生物膜。慢性支气管炎急性发作患者的咯痰涂片可见铜绿假单胞菌形成大量微小的生物膜碎片，其周围有大量游离的裸菌。裸菌可刺激呼吸道黏膜造成感染性炎症[1]。由于临床分离到的产粘液型铜绿假单胞菌呈上升趋势，而我们用常规方法不易鉴定细菌和报告药敏试验，为此我们尝试采用了一种新型的肉汤稀释法与常规的药敏纸片法同时检测临床分离的158株菌株进行鉴定和药敏分析，现将结果报告如下：
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1 资料与方法
1.1一般资料
1.1.1菌株 来自临床分离的158株产粘液型铜绿假单胞菌。均来自痰标本，质控菌株大肠埃希氏菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853。
1.1.2试剂与仪器 哥伦比亚血琼脂和麦康凯、M-H琼脂购自伊华科技有限公司，氧化酶试剂和肉汤购自美国的Sigma公司，药敏纸片购自英国的Oxoi公司，Vitek 2全自动化细菌鉴定药敏仪购自法国生物梅里埃公司。
1.2方法
1.2.1菌株鉴定 大多数患者分离到的产粘液型铜绿假单胞菌在哥伦比亚血平板上35℃培养18～24 h，可见无色无味、露滴状、边缘不规则、不溶血的小菌落。48 h菌落融合为粘稠、胶冻样菌落，部分患者的菌株为淡绿色，溶血可有可无。在麦康凯平板上35℃培养18～24 h菌落为无色无味、粘稠、胶冻样、成片状的大菌落，用接种环不易挑起[2]。培养48 h部分患者菌株的菌落可有淡绿色或浅褐色。氧化酶试验均成阳性，这就可以初步区分下肺炎克雷伯菌(也会有粘液形成，但氧化酶阴性)。用无菌棉棒刮取在血平板上的产粘液型铜绿假单胞菌纯菌落加入营养肉汤中制作菌悬液，将菌悬液管反复颠倒振摇，置于35℃培养18～24 h，然后取上清液制成0.5麦氏单位菌悬液，用VITEK2的GN卡鉴定。
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1.2.2药敏试验 对分离到的158株产粘液型铜绿假单胞菌纸片扩散法在M-H上进行药敏试验，判断标准按照CLSI M100-S24标准执行。同时在VITEK2 上用配套的AST-GN13药敏卡严格按照仪器使用说明书进行药敏测定。
2 结果和分析
2.1两种方法检测158株产粘液型铜绿假单胞菌的药敏结果，见表1。
2.2两种方法的检测结果的统计学分析(SPSS)，见表2。
我们通过软件SPSS分析了各组的药敏结果，从表2中我们可以看到氨曲南、头孢吡肟、头孢他啶、庆大霉素、左氧氟沙星的P<0.05，说明有显著性差异。余下的阿米卡星、环丙沙星、亚胺培南、特治星、妥布霉素的P>0.05，说明无显著性差异。
3 讨论
, http://www.100md.com
产粘液型铜绿假单胞菌自然存在的一种特殊形式，其在黏膜表面产生大量粘液--多糖藻酸盐等，从而持续定植、形成生物膜[3]。产粘液型铜绿假单胞菌在长期慢性呼吸道感染的患者痰标本中检出率高，准确及时的药敏结果更加重要。由于产粘液型铜绿假单胞菌的粘液使该菌生长明显减慢，一般都需要48 h才生长，并且在生理盐水中不容易形成均匀的菌悬液，使我们在上机鉴定和药敏试验时，无法鉴定或者结果不准确。故我们在转纯的时候采用哥伦比亚血琼脂，且生长良好。菌悬液的制备也是采用肉汤使其生长良好而容易鉴定。
我们在采取两种方法检测产粘液型铜绿假单胞菌的药敏时发现敏感组基本差异不大，P=0.649，说明两种方法的结果无差异。而在中介组，P=0.003，说明结果有显著差异。耐药组P=0.040，显示结果有显著差异。这些结果可以这样认为产粘液型铜绿假单胞菌，如果是机器检测药敏的话，结果不是很可靠，可能是生长不良的原因，有些耐药的结果变成中介了，至于敏感的菌株，不管你生长好或是不好，只要对照孔生长，机器肯定会出现敏感的结果，和纸片法应该是符合一致的，所以我们建议采用纸片法或者其他MIC法的方法来检测产粘液型铜绿假单胞菌的药敏。
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在我院分离到的产粘液型铜绿假单胞菌对10种常见的抗生素敏感性高，见表1，耐药性较弱，但在治疗产粘液型铜绿假单胞菌引起的感染时，往往临床反映效果不佳，我们应考虑藻酸盐对铜绿假单胞菌生物膜的形成的耐药性。如果由于生物被膜的作用而难以完全清除的话，就容易在体内寄居，这样就很容易诱发再次感染，而且反复的诱发以及反复的抗感染治疗，就容易导致耐药的形成，很强的定植和粘附能力，以及加上耐药的形成，一旦再次继发感染的话，治疗就更加困难。据小林宏行报道大环内酯类药物可通过抑制藻酸盐合成酶而减少细菌藻酸盐的分泌破坏细菌生物被膜的结构增加其他抗菌药物对细菌生物被膜渗透从而达到与其他抗菌药物联合杀菌的目的[4]。
体内的研究发现大环内酯类抗生素能使生物膜的表面形成孔穴，从而使生物膜内部细菌得以暴露，有利于敏感药物进入生物膜内部杀灭细菌。大环内酯类抗生素可使体内藻酸盐免疫复合物逐渐下降，可有效地抑制由藻酸盐介导的抗原抗体反应。大环内酯类抗生素尚有免疫调节作用，能有效地增强中性粒细胞对铜绿假单胞菌生物膜的吞噬作用；最新的研究发现克拉霉素能明显抑制铜绿假单胞菌菌毛的颤动从而抑制铜绿假单胞菌的致病力，总之，我们认为大环内酯类抗生素在治疗铜绿假单胞菌生物膜感染中具有举足轻重的作用，而这种作用是其他药物所不具备的[5]。
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参考文献：
[1]李彤，庄辉.细菌生物膜的研究进展[J].中华微生物学和免疫学杂志，2002，22(3)：343-346.
[2]周庭银，赵虎.临床微生物学诊断与图解[M].上海：上海科学技术出版社，2001：141.
[3]大垣宪隆，太田见宏，小林宏行.细菌感染症一最新化学疗法[J].临床微生物，1994，21(1)：51.
[4]小林宏行.细菌生物被膜的基础与临床[J].中国临床药理学杂志，1999，15：299-307.
[5]范春，牛其昌，王颖.铜绿假单胞菌生物膜耐药性机制及防治[J].国外医药抗生素分册，2004，25(5)：230-232.编辑/翟辰万, http://www.100md.com(陈慧萍 罗柳林 乐军)