10%尿素乳膏微生物限度检查方法适用性试验的研究(2)
2.2供试液制备 随机取两支供试品(10g/支)，混合，按非无菌产品微生物限度检查法供试品检查规定称取10g，加40℃无菌0.1%吐温溶液至100 ml，用匀浆仪混和均匀，即为1：10的供试品溶液。
2.3需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法的适用性试验 采用常规法(即平皿倾注法)进行3次独立的平行试验。
2.3.1试验组：取1：10供试液10 ml，加上述试验菌液0.1 ml，使每1 ml供试液中含菌量不大于100cfu，取供试液1 ml，置直径90 mm的无菌平皿中，立即注入15～20 ml温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基，平行制备2个平皿，待凝固后置规定温度培养3～5 d，逐日观察结果并记录。
2.3.2菌液对照组：取稀释液代替供试液，按试验组操作。
2.3.3供试品对照组：取制备好的供试液，以无菌0.1%吐温溶液代替菌液同试验组操作。
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2.3.4阴性对照：取无菌0.1%吐温溶液1 ml置90 mm的无菌平皿中，立即注入15～20 ml温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基，平行制备2个平皿，待凝固后置规定温度培养3～5 d，逐日观察结果并记录。
2.3.5实验结果：试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值与菌液对照组平均菌落数的比值应在0.5～2范围内。结果见表2、表3(结果为两皿的平均值)。
从表2、表3可以看出3次平行试验，试验组的菌落数减去供试品对照组的菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值均在0.5～2范围内。
2.4控制菌检查方法的适用性试验 铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检查方法的适用性试验：按常规法进行三次平行试验。
2.4.1试验组：分别取1：10供试液10 ml及上述不大于100cfu的铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌1 ml，分别接种置90 ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，置35℃培养18～24 h，按相应的控制菌检查法检查。
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2.4.2菌液对照组：取稀释液代替供试液，同试验组操作。
2.4.3供试品对照组：取1：10供试液10 ml，以无菌0.1%吐温溶液代替菌液同试验组操作。按相应的控制菌检查法检查。
2.4.4阴性对照组：取无菌0.1%吐温溶液11 ml，接种置90 ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，置35℃培养18～24 h，按相应的控制菌检查方法检查。
2.4.5 实验结果：控制菌检查方法适用性试验结果见表4。
由表4方法适用性试验结果可以看出铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌菌液对照组、试验组生长良好，说明尿素乳膏对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌无抑菌作用或抑菌作用较弱。
3 讨论
3.1由上述验证结果可知，在需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数检查的方法适用性试验中，常规法对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的回收试验均符合要求(即试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值均在0.5～2范围内)；从表4可以看出控制菌铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌的检查可采用常规法。
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3.2为防止阳性菌造成的环境污染，涉及阳性菌的试验均在阳性室的生物安全柜内操作。
3.3方法适用性试验需进行三次平行的独立实验，所加的培养基体积应尽量一致，培养基与所加试液应充分混合均匀。
3.4乳膏供试品不易混和均匀，故实验过程中采用匀浆仪进行搅拌混合。
参考文献：
[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典[S].中国医药科技出版社，2015年版三部：通则80-通则90.
[2]中国药品生物制品检定所，中国药品检验总所.中国药品检验标准操作规范[S].中国医药科技出版社.2010年版：351-369.
[3]国家药典委员会编.中华人民共和国药典[S].中国医药科技出版社，2015：220-221.编辑/金昊天, 百拇医药(方敏)
2.3需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法的适用性试验 采用常规法(即平皿倾注法)进行3次独立的平行试验。
2.3.1试验组：取1：10供试液10 ml，加上述试验菌液0.1 ml，使每1 ml供试液中含菌量不大于100cfu，取供试液1 ml，置直径90 mm的无菌平皿中，立即注入15～20 ml温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基，平行制备2个平皿，待凝固后置规定温度培养3～5 d，逐日观察结果并记录。
2.3.2菌液对照组：取稀释液代替供试液，按试验组操作。
2.3.3供试品对照组：取制备好的供试液，以无菌0.1%吐温溶液代替菌液同试验组操作。
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2.3.4阴性对照：取无菌0.1%吐温溶液1 ml置90 mm的无菌平皿中，立即注入15～20 ml温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基，平行制备2个平皿，待凝固后置规定温度培养3～5 d，逐日观察结果并记录。
2.3.5实验结果：试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值与菌液对照组平均菌落数的比值应在0.5～2范围内。结果见表2、表3(结果为两皿的平均值)。
从表2、表3可以看出3次平行试验，试验组的菌落数减去供试品对照组的菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值均在0.5～2范围内。
2.4控制菌检查方法的适用性试验 铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检查方法的适用性试验：按常规法进行三次平行试验。
2.4.1试验组：分别取1：10供试液10 ml及上述不大于100cfu的铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌1 ml，分别接种置90 ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，置35℃培养18～24 h，按相应的控制菌检查法检查。
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2.4.2菌液对照组：取稀释液代替供试液，同试验组操作。
2.4.3供试品对照组：取1：10供试液10 ml，以无菌0.1%吐温溶液代替菌液同试验组操作。按相应的控制菌检查法检查。
2.4.4阴性对照组：取无菌0.1%吐温溶液11 ml，接种置90 ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，置35℃培养18～24 h，按相应的控制菌检查方法检查。
2.4.5 实验结果：控制菌检查方法适用性试验结果见表4。
由表4方法适用性试验结果可以看出铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌菌液对照组、试验组生长良好，说明尿素乳膏对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌无抑菌作用或抑菌作用较弱。
3 讨论
3.1由上述验证结果可知，在需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数检查的方法适用性试验中，常规法对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的回收试验均符合要求(即试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值均在0.5～2范围内)；从表4可以看出控制菌铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌的检查可采用常规法。
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3.2为防止阳性菌造成的环境污染，涉及阳性菌的试验均在阳性室的生物安全柜内操作。
3.3方法适用性试验需进行三次平行的独立实验，所加的培养基体积应尽量一致，培养基与所加试液应充分混合均匀。
3.4乳膏供试品不易混和均匀，故实验过程中采用匀浆仪进行搅拌混合。
参考文献：
[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典[S].中国医药科技出版社，2015年版三部：通则80-通则90.
[2]中国药品生物制品检定所，中国药品检验总所.中国药品检验标准操作规范[S].中国医药科技出版社.2010年版：351-369.
[3]国家药典委员会编.中华人民共和国药典[S].中国医药科技出版社，2015：220-221.编辑/金昊天, 百拇医药(方敏)