三氧化二砷对人成纤维样滑膜细胞生长的影响
摘要：目的 观察三氧化二砷(ATO)对人关节成纤维样滑膜细胞(FLSs)生长的影响，探讨ATO对类风湿关节炎(KA)的潜在治疗作用。方法 原代培养人关节FLSs，传至第3-5代时，以不同浓度的ATO处理细胞，通过ELISA对上清液中的TNF-a、IL-1水平进行检测，采用MTT法检测不同处理组细胞生长情况。结果 不同浓度的ATO处理后，ELISA结果显示试验各组TNF-d、IL-1检出水平均显著低于对照组(P<0.05)，MTT结果显示随药物浓度增加和处理时间延长，抑制作用增强。结论 ATO可抑制人FLSs生长，并可发挥抑制滑膜细胞分泌的功效，进而对RA炎性、免疫过程产生干预作用，提示可作为治疗RA的潜在药物。
关键词：三氧化二砷；成纤维样滑膜细胞；类风湿关节炎
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以关节滑膜炎为特征的慢性全身性自身免疫性疾病，其发病机制在目前临床研究中尚未形成统一认知，但既往大量报道中均提示关节滑膜的异常增殖反应在骨组织、软骨组织的侵袭与破坏中有着非常重要的作用，这一机制提示三氧化二砷(arsemic trioxide，ATO)可能通过抑制细胞增殖，加速细胞凋亡的方式发挥对RA疾病的治疗效果。研究。引显示人成纤维样滑膜细胞(6broblast-like synoviocytes，FLSs)的过度增生和分泌在RA的发病和发展中具有重要作用。本研究通过观察ATO对人FLSs生长的影响，探讨ATO是否对RA具有潜在的治疗作用。
, 百拇医药
1.资料与方法
1.1一般资料 采集2015年5月-2015年11月在我院风湿科住院的RA患者的关节积液4例(男1例，女3例，41-67岁，平均年龄55.4岁)，体外原代培养人FLSs。三氧化二砷(ATO)(10 mg/瓶，购自哈尔滨制药有限公司)；ELISA试剂盒(南京凯基生物科技發展有限公司)
1.2方法
1.2.1人FLSs培养，方法参照文献。4例患者的关节滑液经处理后均成功获得大量成纤维样细胞，经鉴定该细胞为CD68阴性细胞，即FLSs。倒置显微镜观察细胞生长情况，取第3-5代细胞用于实验。
1.2.2 ELISA检测 将滑膜细胞按1x10个/孔接种于6孔板中，每个标本的细胞接种4孔，每孔1组，培养24 h，按照A-TO终浓度0 umol/L、0.5 umol/L、2.0 umol/L和8.0 umol/L加入相应培养孔中继续培养。4孔分别为对照组(0 umol/L)、试验1组(0.5 umol/L)、试验2组(2.0 umo]/L)和试验3组(8.0umol/L)。将反应24 h后的上清液取出，并通过ELISA法对上清液中TNF-a、IL-1水平进行检测。
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1.2.3 MTT检测 将滑膜细胞按5x10个，孔接种于96孔板中，每个标本的细胞接种24孔，6孔1组，培养24 h，每组加入相应药物浓度与前述完全一致，另设空白(只加培养液)组6孔。培养1 d、2 d、3 d、4 d和5 d后，吸去原培养液，每孔加200ul无血清H-DMEM培养液及20ul的MTr(5mg/ml)，继续培养4 h。小心弃上清，每孔加入150 ul DMSO，混匀10min后，在酶标仪上测定各孔490 nm处的吸光度A值，最后计算细胞抑制率。
1.3观察指标 对比对照组、试验各组细胞TNF-a、IL-1的检出水平差异，并观察各组ATO对人FLSs的生长状况。
1.4统计学处理 用SPSS 19.0统计软件进行数据处理，计量资料表示为(x±s)，用t检验；计数资料表示为[n(%)]，用x2检验，P<0.05时为差异具有统计学意义。
2.结果
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2.1 ELISA结果 试验各组TNF-a、IL-1检出水平均显著低于对照组(P<0.05)；试验3组TNF-a、IL-1检出水平显著低于试验2组、1组(P<0.05)；试验2 TNF-a、IL-1检出水平显著低于试验1组(P<0.05)，见表1。
2.2 MTT结果对照组细胞生长良好，观察第1-2 d对照组与试验各组对比无明显差异(P>0.05)；第3 d开始，试验各组活细胞数显著低于对照组(P<0.05)，且浓度越高，作用剂量依赖性越显著，见图1。
3.讨论
RA是目前临床上比较常见的一种自身免疫性疾病，其病因尚未明确。研究表明，FLSs过度增生和分泌是RA发病的重要基础，参与关节的炎症发展和关节破坏。FLSs可表现出转化细胞的特征，呈类肿瘤细胞样异常增殖，侵入到软骨和软骨下的骨质，并产生炎性介质、促炎症细胞因子及抗炎症细胞因子、分泌基质金属蛋白酶等。TNF-a以及IL-1是RA发生、发展过程中重要的炎症因子，抑制FLSs的增殖和活化是目前研究RA的热点，可能为临床上治疗RA提供新的思路或靶点。
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ATO是传统中药砒石的主要成分，对K562、NB4等肿瘤细胞的增殖有抑制作用，FLSs具有肿瘤细胞样异常增殖的特性，故本研究拟探讨ATO是否能影响人FLSs的生长，不同浓度的ATO处理FLSs后。ELISA结果：试验各组TNF-a、IL-1检出水平均显著低于对照组(P<0.05)；MTT显示：细胞生长均受到不同程度的抑制，随药物浓度增加，抑制效果增强。与对照组细胞的吸光度A值比较差异有统计学意义(P<0.05)。提示ATO能抑制人FLSs的增殖。
滑膜增生是RA的特征性病理表现，增生的滑膜可形成血管翳依附于软骨表面，介导骨和软骨的破坏，FLSs凋亡不足与滑膜增生有关。介导FLSs凋亡可能是治疗RA的有效途径。本研究通过ELISA和MTT检测ATO可以有效抑制人FLSs中TNF-a、IL-1的水平，对炎症以及免疫反应产生抑制效果，ATO能够促进人FLSs的凋亡，对人FLSs增殖反应抑制效果确切，通过影响细胞内活性氧类物质代谢的方式加速细胞凋亡，进而发挥治疗效果。细胞凋亡是一个复杂的、严格受多基因调控的主动细胞死亡过程。因此，关于ATO通过怎样的途径诱导人FLSs凋亡还需要进一步研究。总之，ATO能影响人FLSs的生长，可作为治疗RA的潜在药物。, http://www.100md.com(蒋红 贾艾敏 刘琬椿等)
关键词：三氧化二砷；成纤维样滑膜细胞；类风湿关节炎
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以关节滑膜炎为特征的慢性全身性自身免疫性疾病，其发病机制在目前临床研究中尚未形成统一认知，但既往大量报道中均提示关节滑膜的异常增殖反应在骨组织、软骨组织的侵袭与破坏中有着非常重要的作用，这一机制提示三氧化二砷(arsemic trioxide，ATO)可能通过抑制细胞增殖，加速细胞凋亡的方式发挥对RA疾病的治疗效果。研究。引显示人成纤维样滑膜细胞(6broblast-like synoviocytes，FLSs)的过度增生和分泌在RA的发病和发展中具有重要作用。本研究通过观察ATO对人FLSs生长的影响，探讨ATO是否对RA具有潜在的治疗作用。
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1.资料与方法
1.1一般资料 采集2015年5月-2015年11月在我院风湿科住院的RA患者的关节积液4例(男1例，女3例，41-67岁，平均年龄55.4岁)，体外原代培养人FLSs。三氧化二砷(ATO)(10 mg/瓶，购自哈尔滨制药有限公司)；ELISA试剂盒(南京凯基生物科技發展有限公司)
1.2方法
1.2.1人FLSs培养，方法参照文献。4例患者的关节滑液经处理后均成功获得大量成纤维样细胞，经鉴定该细胞为CD68阴性细胞，即FLSs。倒置显微镜观察细胞生长情况，取第3-5代细胞用于实验。
1.2.2 ELISA检测 将滑膜细胞按1x10个/孔接种于6孔板中，每个标本的细胞接种4孔，每孔1组，培养24 h，按照A-TO终浓度0 umol/L、0.5 umol/L、2.0 umol/L和8.0 umol/L加入相应培养孔中继续培养。4孔分别为对照组(0 umol/L)、试验1组(0.5 umol/L)、试验2组(2.0 umo]/L)和试验3组(8.0umol/L)。将反应24 h后的上清液取出，并通过ELISA法对上清液中TNF-a、IL-1水平进行检测。
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1.2.3 MTT检测 将滑膜细胞按5x10个，孔接种于96孔板中，每个标本的细胞接种24孔，6孔1组，培养24 h，每组加入相应药物浓度与前述完全一致，另设空白(只加培养液)组6孔。培养1 d、2 d、3 d、4 d和5 d后，吸去原培养液，每孔加200ul无血清H-DMEM培养液及20ul的MTr(5mg/ml)，继续培养4 h。小心弃上清，每孔加入150 ul DMSO，混匀10min后，在酶标仪上测定各孔490 nm处的吸光度A值，最后计算细胞抑制率。
1.3观察指标 对比对照组、试验各组细胞TNF-a、IL-1的检出水平差异，并观察各组ATO对人FLSs的生长状况。
1.4统计学处理 用SPSS 19.0统计软件进行数据处理，计量资料表示为(x±s)，用t检验；计数资料表示为[n(%)]，用x2检验，P<0.05时为差异具有统计学意义。
2.结果
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2.1 ELISA结果 试验各组TNF-a、IL-1检出水平均显著低于对照组(P<0.05)；试验3组TNF-a、IL-1检出水平显著低于试验2组、1组(P<0.05)；试验2 TNF-a、IL-1检出水平显著低于试验1组(P<0.05)，见表1。
2.2 MTT结果对照组细胞生长良好，观察第1-2 d对照组与试验各组对比无明显差异(P>0.05)；第3 d开始，试验各组活细胞数显著低于对照组(P<0.05)，且浓度越高，作用剂量依赖性越显著，见图1。
3.讨论
RA是目前临床上比较常见的一种自身免疫性疾病，其病因尚未明确。研究表明，FLSs过度增生和分泌是RA发病的重要基础，参与关节的炎症发展和关节破坏。FLSs可表现出转化细胞的特征，呈类肿瘤细胞样异常增殖，侵入到软骨和软骨下的骨质，并产生炎性介质、促炎症细胞因子及抗炎症细胞因子、分泌基质金属蛋白酶等。TNF-a以及IL-1是RA发生、发展过程中重要的炎症因子，抑制FLSs的增殖和活化是目前研究RA的热点，可能为临床上治疗RA提供新的思路或靶点。
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ATO是传统中药砒石的主要成分，对K562、NB4等肿瘤细胞的增殖有抑制作用，FLSs具有肿瘤细胞样异常增殖的特性，故本研究拟探讨ATO是否能影响人FLSs的生长，不同浓度的ATO处理FLSs后。ELISA结果：试验各组TNF-a、IL-1检出水平均显著低于对照组(P<0.05)；MTT显示：细胞生长均受到不同程度的抑制，随药物浓度增加，抑制效果增强。与对照组细胞的吸光度A值比较差异有统计学意义(P<0.05)。提示ATO能抑制人FLSs的增殖。
滑膜增生是RA的特征性病理表现，增生的滑膜可形成血管翳依附于软骨表面，介导骨和软骨的破坏，FLSs凋亡不足与滑膜增生有关。介导FLSs凋亡可能是治疗RA的有效途径。本研究通过ELISA和MTT检测ATO可以有效抑制人FLSs中TNF-a、IL-1的水平，对炎症以及免疫反应产生抑制效果，ATO能够促进人FLSs的凋亡，对人FLSs增殖反应抑制效果确切，通过影响细胞内活性氧类物质代谢的方式加速细胞凋亡，进而发挥治疗效果。细胞凋亡是一个复杂的、严格受多基因调控的主动细胞死亡过程。因此，关于ATO通过怎样的途径诱导人FLSs凋亡还需要进一步研究。总之，ATO能影响人FLSs的生长，可作为治疗RA的潜在药物。, http://www.100md.com(蒋红 贾艾敏 刘琬椿等)