抚顺市2014年肠道病毒71型VP1区基因特征分析(2)
2.2病毒的常规分离 我们采用人横纹肌肉瘤细胞(RD)和非洲绿猴肾细胞(VERO)两种细胞做病毒分离，将所采集的9份阳性标本分别加入细胞中，每份标本在三种细胞上至少传三代，共观察21 d。其中有8份标本在VERO细胞出现了明显的CPE，出现细胞肿胀、变圆、聚集成葡萄串状的病变；5份标本在RD细胞出现了明显的CPE，出现细胞皱缩、变圆脱落的病变。通过用两种细胞进行培养，我们共分离出了8份阳性病毒液，其中有5份标本在RD和VERO细胞上都有病变，3份标本只在VERO细胞上有病变，说明对肠道病毒EV71型，VERO细胞更为敏感。
2.3分离株的RT-PCR检测 从8份阳性标本中提取病毒DNA，用EV71病毒VP1区引物进行PCR扩增。扩增条带经琼脂糖凝胶电泳显示，片段大小在1056 bp左右，条带清晰无杂带[4]，PCR扩增片段经TA克隆并进行测序。將病毒序列在GenBank中用Blastn进行比对分析，发现与C4亚型代表株具有最高的核苷酸序列及氨基酸序列的同源性，因此8株病毒为肠道病毒EV71行C4亚型。
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2.4肠道病毒EV71型的进化树分析 分离株EV71型的VP1区核苷酸序列长度均为891个核苷酸，编码297个氨基酸。VP1区核苷酸分为A、B、C三个基因型[3]，其中B又可分B1 B4基因亚型、C分为C1 C4四个亚型。在GenBank中检索表明：随机选取的2株EV71分离与C4亚型代表株的核苷酸序列同源性较高，在亲缘进化树上，属于C4基因亚型进化分支，为2014年流行株的分子流行病学特征。其构建的2株分离株与各代表株间的基因亲缘性进化树(见图1)。
3 讨论
全球最早报道手足口病流行的国家为新西兰，随后陆续在其它国家和地区均有此病的报道。近年来，随着疾病的流行，我国学者对肠道病毒EV71基因型的研究也逐渐深入，如吕莉琨等人对天津地区引起的HFMD已进行了分子流行病学的研究，尤其是2008年阜阳市引起HFMD爆发疫情后，引起了社会的广泛关注，对EV71的分子流行病学研究也越来越多，而研究的重点集中在VP1区基因序列分析上，VP1基因具有与病毒血清型完全对应的遗传多样性[5]，可作为肠道病毒属内血清型分类依据。根据VP1核苷酸序列的差异，将EV71分为A、B、C3个基因型，B型又细分为B1～B5[6]，C型细分为C1～C5，是我国主要流行株，也是2014年抚顺市HFMD疫情的流行株。
, 百拇医药
通过构建种系进化树模型，分离得到的2株分离株与C4亚型连接为一小簇，并且与A、B基因型在遗传点位上相距较远，说明2株分离株均为C4亚型，这与吕莉琨等人的研究相似[7]，并与中国大陆目前流行的EV71的优势基因亚型一致[8]；其次，2个样本在进化树构建中密切相连，簇状排列，属于单源进化。
EV71感染是对儿童威胁性较大的病毒性疾病之一，每年都有儿童因感染EV71而死亡的报道，尽管台湾及邻近的国家均报道有多种基因型、亚型的流行，但中国大陆报道的流行株仍以C4亚型为主，病毒变异不大，由于EV71对VERO细胞敏感，VERO细胞是WHO推荐的可以用于疫苗生产的细胞，其安全性在疫苗生产中已经得到了充分的验证，这就为EV71疫苗的研制提供了基础，目前我国已经研制出了EV71疫苗，并在临床上已经加以应用，这种对儿童威胁性较大的病毒性疾病今后一定会得到有效的控制。
参考文献：
[1]刘佳，夏玛丽，黄江河，等.2013年克拉玛依市手足口病EV71型VP1基因特征分析[J].中国卫生检验杂志，2015，1(25)：238-244.
, 百拇医药
[2]龚黎明，葛琼，严菊英，等.浙江省肠道病毒71型的分离与VP1区域序列分析[J].中华流行病杂志，2005，26(12)：971-974.
[3]于伟，姚文清，陈静乙.辽宁省2008年-2009年肠道病毒71型VP1区基因特征分析[J].中国卫生检验杂志，2011，4(21)：987-992.
[4]张眉眉，于伟，孙海波，等.辽宁省首株人腺病毒14型的分离与鉴定[J].疾病监测，2014，9(29)：684-687.
[5]邵强，杨全中，冯真真，等.肠道病毒71型安徽、河南株的分离与VP1区序列进化分析[J].生物技术通报，2011，3：150-154.
[6]付建军，王海峰，马超峰，等.西安市手足口病肠道病毒71型分离株VP1区基因特征分析 [J].浙江临床医学，2014，9(16)：1363-1365.
[7]吕莉琨，李力，李佳萌，等.天津地区肠道病毒71型的分子特征分析[J].中国卫生检验杂志，2009，10(19)：2236-2239.
[8]范丽霞，巴卓玛，冀天骄，等.2012年青海省肠道病毒71型VP1区基因特征分析[J].医学动物防制，2013，4(29)：361-363.
编辑/钱洪飞, 百拇医药(李冰洁)
2.3分离株的RT-PCR检测 从8份阳性标本中提取病毒DNA，用EV71病毒VP1区引物进行PCR扩增。扩增条带经琼脂糖凝胶电泳显示，片段大小在1056 bp左右，条带清晰无杂带[4]，PCR扩增片段经TA克隆并进行测序。將病毒序列在GenBank中用Blastn进行比对分析，发现与C4亚型代表株具有最高的核苷酸序列及氨基酸序列的同源性，因此8株病毒为肠道病毒EV71行C4亚型。
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2.4肠道病毒EV71型的进化树分析 分离株EV71型的VP1区核苷酸序列长度均为891个核苷酸，编码297个氨基酸。VP1区核苷酸分为A、B、C三个基因型[3]，其中B又可分B1 B4基因亚型、C分为C1 C4四个亚型。在GenBank中检索表明：随机选取的2株EV71分离与C4亚型代表株的核苷酸序列同源性较高，在亲缘进化树上，属于C4基因亚型进化分支，为2014年流行株的分子流行病学特征。其构建的2株分离株与各代表株间的基因亲缘性进化树(见图1)。
3 讨论
全球最早报道手足口病流行的国家为新西兰，随后陆续在其它国家和地区均有此病的报道。近年来，随着疾病的流行，我国学者对肠道病毒EV71基因型的研究也逐渐深入，如吕莉琨等人对天津地区引起的HFMD已进行了分子流行病学的研究，尤其是2008年阜阳市引起HFMD爆发疫情后，引起了社会的广泛关注，对EV71的分子流行病学研究也越来越多，而研究的重点集中在VP1区基因序列分析上，VP1基因具有与病毒血清型完全对应的遗传多样性[5]，可作为肠道病毒属内血清型分类依据。根据VP1核苷酸序列的差异，将EV71分为A、B、C3个基因型，B型又细分为B1～B5[6]，C型细分为C1～C5，是我国主要流行株，也是2014年抚顺市HFMD疫情的流行株。
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通过构建种系进化树模型，分离得到的2株分离株与C4亚型连接为一小簇，并且与A、B基因型在遗传点位上相距较远，说明2株分离株均为C4亚型，这与吕莉琨等人的研究相似[7]，并与中国大陆目前流行的EV71的优势基因亚型一致[8]；其次，2个样本在进化树构建中密切相连，簇状排列，属于单源进化。
EV71感染是对儿童威胁性较大的病毒性疾病之一，每年都有儿童因感染EV71而死亡的报道，尽管台湾及邻近的国家均报道有多种基因型、亚型的流行，但中国大陆报道的流行株仍以C4亚型为主，病毒变异不大，由于EV71对VERO细胞敏感，VERO细胞是WHO推荐的可以用于疫苗生产的细胞，其安全性在疫苗生产中已经得到了充分的验证，这就为EV71疫苗的研制提供了基础，目前我国已经研制出了EV71疫苗，并在临床上已经加以应用，这种对儿童威胁性较大的病毒性疾病今后一定会得到有效的控制。
参考文献：
[1]刘佳，夏玛丽，黄江河，等.2013年克拉玛依市手足口病EV71型VP1基因特征分析[J].中国卫生检验杂志，2015，1(25)：238-244.
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[2]龚黎明，葛琼，严菊英，等.浙江省肠道病毒71型的分离与VP1区域序列分析[J].中华流行病杂志，2005，26(12)：971-974.
[3]于伟，姚文清，陈静乙.辽宁省2008年-2009年肠道病毒71型VP1区基因特征分析[J].中国卫生检验杂志，2011，4(21)：987-992.
[4]张眉眉，于伟，孙海波，等.辽宁省首株人腺病毒14型的分离与鉴定[J].疾病监测，2014，9(29)：684-687.
[5]邵强，杨全中，冯真真，等.肠道病毒71型安徽、河南株的分离与VP1区序列进化分析[J].生物技术通报，2011，3：150-154.
[6]付建军，王海峰，马超峰，等.西安市手足口病肠道病毒71型分离株VP1区基因特征分析 [J].浙江临床医学，2014，9(16)：1363-1365.
[7]吕莉琨，李力，李佳萌，等.天津地区肠道病毒71型的分子特征分析[J].中国卫生检验杂志，2009，10(19)：2236-2239.
[8]范丽霞，巴卓玛，冀天骄，等.2012年青海省肠道病毒71型VP1区基因特征分析[J].医学动物防制，2013，4(29)：361-363.
编辑/钱洪飞, 百拇医药(李冰洁)