抚顺市2014年肠道病毒71型VP1区基因特征分析(1)
摘要：目的 探讨抚顺市2014年手足口病(HFMD)相同来源肠道病毒71型分离株(EV71)的VP1区基因特征。方法 从2014年手足口患者20份咽拭标本中进行EV71病毒分离，随机挑取2株分离株经RT-PCR扩增VP1区，并对扩增产物进行核苷酸序列分析，构建2株分离株与各代表株间的基因亲缘性进化树。结果 在对2株EV71进行VP1区基因测定显示：与C4亚型代表株的核苷酸序列同源性较高，在亲缘进化树上，属于C4基因亚型进化分支。结论 从HFMD患者中分离出的EV71为C4基因亚型进化分支，在亲缘性进化树中为紧密相连的一小簇，呈单源进化关系。
关键词：肠道病毒EV71型；手足口病；基因特征
Analysis of Genotype of VP1 Region of Enterovirus 71 in Fushun City， 2014
LI Bing-jie
, http://www.100md.com
(Fushun City Health School，Fushun 113006，Liaoning，China)
Abstract：Objective To investigate the VP1 gene characteristics of enterovirus 71 isolate(EV71)，the same source of HFMD in Fushun City，2014. Methods The EV71 virus was isolated from 20 swallow specimens of hand，foot and mouth in 2014.Two VP1 isolates were amplified by RT-PCR and the amplified products were analyzed by nucleotide sequence analysis.Two isolates were constructed Gene-related phylogenetic trees between the plant and the representative.Results The VP1 gene of two EV71 showed that the nucleotide sequence of C4 subtype was higher than that of C4 subtype，and belonged to C4 subtype evolutionary branch in kinship phylogenetic tree.Conclusion EV71 isolated from HFMD patients is an evolutionary branch of C4 gene subtype，and it is a small cluster closely connected in phylogenetic tree，showing a single evolutionary relationship.
, 百拇医药
Key words：Enterovirus EV71；Hand，foot and mouth disease；Genetic characteristics
腸道病毒71型(EV71)在分类上属于小RNA病毒科肠道病毒属，主要通过人群间的密切接触传播，也可经消化道传播，引起手足口病(HFMD)、类脊髓灰质炎脑炎等疾病。尤其是手足口病，由于其传染性强、传播速度快、儿童病死率较高等特征，因此备受重视[1]，被列为国家法定传染病，并且近几年也已引起社会广泛的重视。据不完全统计，在丙类传染病中，HFMD报告发病数和报告死亡数均已跃居前位。为了解抚顺市手足口病基因特征，于2014年对HFMD患儿的咽拭子标本进行鉴定及EV71病毒进行了深入分析与探讨。
1 材料与方法
1.1临床标本 采集抚顺市某医院2014年6月～9月临床诊断为HFMD的20例患儿的咽拭子标本，装入特定采集管中，-70 ℃冰箱冻存备用。
, http://www.100md.com
1.2病毒分离鉴定 将发病3 d内的咽拭子标本分别接种于人横纹肌肉瘤细胞和非洲绿猴肾细胞中，每份标本在两种细胞中各接种3管，每天观察细胞病变，连续培养7 d，并至少传2代，当出现细胞病变后，则使用荧光定量PCR(Real time-PCR)方法进行鉴定。
1.3病毒RNA核酸提取 取收获的病毒上清液，使用核酸提取仪，应用 Minibest Viral RNA Kit(TAKARA，Cat，No： DV818A)按照说明书进行提取病毒核酸。
1.4病毒核酸PCR荧光检测 应用肠道病毒EV71核酸试剂盒说明书进行PCR扩增，采用Real time-PCR方法检测，在PCR仪上进行荧光定量分析。
1.5 RT-PCR法扩增EV71病毒VP1区 VP1区引物序列设计参见文献[2]，用全长VP1区基因片段EV71VP1F和EV71VP1R作为引物，在此扩增引物基础上进行RT-PCR，其反应条件：50 ℃ 30 min、93 ℃ 3 min、95 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、68 ℃ 2 min，经35个循环，72 ℃延伸10 min，转入4 ℃ 10min，预计产物大小为1015 bp，并对肠道病毒EV71的VP1区进行核酸序列测定。
1.6 EV71VP1区核苷酸序列测定和分析 用QIAquick Gel Extraction Kit[3]试剂盒进行纯化，并对测序的产物标记，在ABI-310型核苷酸自动测序分析仪上检测，所得结果用MEGA4构建进化树，采用NCBI的GenBank的数据库对比分析。
2 结果
2.1标本的核酸检测结果 对所采集的20份标本用 Real time-PCR检测方法进行肠道病毒EV71型检测，检测结果是其中9份标本的CT值小于35，可以确定为EV71阳性标本。, 百拇医药(李冰洁)
关键词：肠道病毒EV71型；手足口病；基因特征
Analysis of Genotype of VP1 Region of Enterovirus 71 in Fushun City， 2014
LI Bing-jie
, http://www.100md.com
(Fushun City Health School，Fushun 113006，Liaoning，China)
Abstract：Objective To investigate the VP1 gene characteristics of enterovirus 71 isolate(EV71)，the same source of HFMD in Fushun City，2014. Methods The EV71 virus was isolated from 20 swallow specimens of hand，foot and mouth in 2014.Two VP1 isolates were amplified by RT-PCR and the amplified products were analyzed by nucleotide sequence analysis.Two isolates were constructed Gene-related phylogenetic trees between the plant and the representative.Results The VP1 gene of two EV71 showed that the nucleotide sequence of C4 subtype was higher than that of C4 subtype，and belonged to C4 subtype evolutionary branch in kinship phylogenetic tree.Conclusion EV71 isolated from HFMD patients is an evolutionary branch of C4 gene subtype，and it is a small cluster closely connected in phylogenetic tree，showing a single evolutionary relationship.
, 百拇医药
Key words：Enterovirus EV71；Hand，foot and mouth disease；Genetic characteristics
腸道病毒71型(EV71)在分类上属于小RNA病毒科肠道病毒属，主要通过人群间的密切接触传播，也可经消化道传播，引起手足口病(HFMD)、类脊髓灰质炎脑炎等疾病。尤其是手足口病，由于其传染性强、传播速度快、儿童病死率较高等特征，因此备受重视[1]，被列为国家法定传染病，并且近几年也已引起社会广泛的重视。据不完全统计，在丙类传染病中，HFMD报告发病数和报告死亡数均已跃居前位。为了解抚顺市手足口病基因特征，于2014年对HFMD患儿的咽拭子标本进行鉴定及EV71病毒进行了深入分析与探讨。
1 材料与方法
1.1临床标本 采集抚顺市某医院2014年6月～9月临床诊断为HFMD的20例患儿的咽拭子标本，装入特定采集管中，-70 ℃冰箱冻存备用。
, http://www.100md.com
1.2病毒分离鉴定 将发病3 d内的咽拭子标本分别接种于人横纹肌肉瘤细胞和非洲绿猴肾细胞中，每份标本在两种细胞中各接种3管，每天观察细胞病变，连续培养7 d，并至少传2代，当出现细胞病变后，则使用荧光定量PCR(Real time-PCR)方法进行鉴定。
1.3病毒RNA核酸提取 取收获的病毒上清液，使用核酸提取仪，应用 Minibest Viral RNA Kit(TAKARA，Cat，No： DV818A)按照说明书进行提取病毒核酸。
1.4病毒核酸PCR荧光检测 应用肠道病毒EV71核酸试剂盒说明书进行PCR扩增，采用Real time-PCR方法检测，在PCR仪上进行荧光定量分析。
1.5 RT-PCR法扩增EV71病毒VP1区 VP1区引物序列设计参见文献[2]，用全长VP1区基因片段EV71VP1F和EV71VP1R作为引物，在此扩增引物基础上进行RT-PCR，其反应条件：50 ℃ 30 min、93 ℃ 3 min、95 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、68 ℃ 2 min，经35个循环，72 ℃延伸10 min，转入4 ℃ 10min，预计产物大小为1015 bp，并对肠道病毒EV71的VP1区进行核酸序列测定。
1.6 EV71VP1区核苷酸序列测定和分析 用QIAquick Gel Extraction Kit[3]试剂盒进行纯化，并对测序的产物标记，在ABI-310型核苷酸自动测序分析仪上检测，所得结果用MEGA4构建进化树，采用NCBI的GenBank的数据库对比分析。
2 结果
2.1标本的核酸检测结果 对所采集的20份标本用 Real time-PCR检测方法进行肠道病毒EV71型检测，检测结果是其中9份标本的CT值小于35，可以确定为EV71阳性标本。, 百拇医药(李冰洁)