有限稀释法分离纯化人牙周膜干细胞的实验研究(2)
经成骨诱导液培养7 d后，复层生长的 PDLSCs 基质中可见褐色结节，并随时间逐渐增多。培养14 d，茜素红染色，显示PDLSCs矿化结节，见图2。
2.3成脂分化能力分析
经成脂诱导液培养7 d后，即可见细胞中有黄色小脂滴出现，主要集中于细胞核周围。诱导14 d时，油红O染色可见脂滴呈橘红色，见图3。
3 讨论
牙周膜干细胞具有成体干细胞自我更新和多向分化的特点，是牙周组织工程的重要种子细胞。研究者从正常[4]、老年人[5]、糖尿病[6]和慢性牙周炎[7-8]的牙周膜组织中分离出了PDLSCs。学者们利用各种不同的方法分离和培养PDLSCs。常用的方法有免疫磁珠分选法、流式细胞分选方法、有限克隆稀释法。
免疫磁珠法是Seo等学者使用的PDLSCs分离方法，其分离细胞的原理是通过免疫学抗原抗体结合作用达到分离的目的，此方法的缺点是价格昂贵，分选效率低等[9]。流式细胞仪分离法其原理是利用不同大小的细胞带有不同電荷，进入电场中的偏离角度不同达到分离目的[10]。该方法分离速度快，但缺点是需特殊的仪器，且价格昂贵，要求细胞数量多。
, http://www.100md.com
考虑到细胞量、费用和细胞纯度等多方面的因素，本研究使用有限稀释法。分离纯化所得到的PDLSCs均为间充质干细胞的长梭形或者不规则形，能形成呈放射状或者为旋涡状集落生长单细胞克隆，克隆形成率高的细胞也具有高增殖能力。分化实验显示，PDLSCs可以向成骨和脂肪细胞分化，说明分离纯化所得的细胞具有干细胞多向分化的能力，与其它的研究结果相一致。与其它方法相比，有限稀释法是一种相对简单的干细胞分离方法。此方法不需要特殊设备，实验耗费小，适合大批量的克隆纯化培养。
因此，有限稀释法操作简单，所得的PDLSCs来源可靠，细胞的生物学特性均一，保证了实验用细胞的稳定性，是对PDLSCs的深入研究和应用提供细胞来源的有效干细胞分离纯化方法。
参考文献：
[1]徐莉雅，马楠，仇丽鸿，等.慢性根尖周炎中Wnt5a与骨吸收的关系[J].口腔医学研究，2016，32(2)：172-176.
, 百拇医药
[2]张琳琳，毕春升，陈发明，等.同一个体来源正常与炎性牙周膜干细胞生物学性能的比较[J].牙体牙髓牙周病学杂志，2015，25(1)：1-7.
[3]X Fu，L Jin，P Ma，et al.Allogeneic stem cells from deciduous teeth in treatment for periodontitis in miniature swine[J].Journal of Periodontology，2014，85(6)：845-851.
[4]Du J，Shan Z，Ma P，et al.Allogeneic bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for periodontal regeneration[J]. Journal of Dental Research，2014，93(2)：183-188.
, http://www.100md.com
[5]Bickford P C，Kaneko Y，Grimmig B，et al.Nutraceutical intervention reverses the negative effects of blood from aged rats on stem cells[J].AGE，2015，37(5)：1-7.
[6]Liu Q，Hu CH，Zhou CH，et al.DKK1 rescues osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells isolated from periodontal ligaments of patients with diabetes mellitus induced periodontitis[J].Sci Rep，2015，17(5)：13142.
[7]李晓光，郭小龙，郭斌.BMAL1基因对骨髓间充质干细胞成骨分化的调控作用[J].华西口腔医学杂志，2016，34(3)：312-316.
, 百拇医药
[8]刘亚丽，刘文佳，胡成虎，等.牙周慢性炎症对牙周膜干细胞生物学特性的影响[J].牙体牙髓牙周病学杂志，2014，24(1)：21-25.
[9]刘娟，孟波，赵华，等.人牙周膜细胞不同分离培养方法的比较研究[J].广东牙病防治，2011，19(12)：631-634.
[10]Greve B，Kelsch R，Spaniol K，et al.Flow cytometry in cancer stem cell analysis and separation[J].Cytometry Part A the Journal of the International Society for Analytical Cytology，2012，81A(4)：284-293.编辑/杨倩, http://www.100md.com(任娅岚 张湘宜 陈思思 白玲 刘春竹 刘亚丽)
2.3成脂分化能力分析
经成脂诱导液培养7 d后，即可见细胞中有黄色小脂滴出现，主要集中于细胞核周围。诱导14 d时，油红O染色可见脂滴呈橘红色，见图3。
3 讨论
牙周膜干细胞具有成体干细胞自我更新和多向分化的特点，是牙周组织工程的重要种子细胞。研究者从正常[4]、老年人[5]、糖尿病[6]和慢性牙周炎[7-8]的牙周膜组织中分离出了PDLSCs。学者们利用各种不同的方法分离和培养PDLSCs。常用的方法有免疫磁珠分选法、流式细胞分选方法、有限克隆稀释法。
免疫磁珠法是Seo等学者使用的PDLSCs分离方法，其分离细胞的原理是通过免疫学抗原抗体结合作用达到分离的目的，此方法的缺点是价格昂贵，分选效率低等[9]。流式细胞仪分离法其原理是利用不同大小的细胞带有不同電荷，进入电场中的偏离角度不同达到分离目的[10]。该方法分离速度快，但缺点是需特殊的仪器，且价格昂贵，要求细胞数量多。
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考虑到细胞量、费用和细胞纯度等多方面的因素，本研究使用有限稀释法。分离纯化所得到的PDLSCs均为间充质干细胞的长梭形或者不规则形，能形成呈放射状或者为旋涡状集落生长单细胞克隆，克隆形成率高的细胞也具有高增殖能力。分化实验显示，PDLSCs可以向成骨和脂肪细胞分化，说明分离纯化所得的细胞具有干细胞多向分化的能力，与其它的研究结果相一致。与其它方法相比，有限稀释法是一种相对简单的干细胞分离方法。此方法不需要特殊设备，实验耗费小，适合大批量的克隆纯化培养。
因此，有限稀释法操作简单，所得的PDLSCs来源可靠，细胞的生物学特性均一，保证了实验用细胞的稳定性，是对PDLSCs的深入研究和应用提供细胞来源的有效干细胞分离纯化方法。
参考文献：
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[4]Du J，Shan Z，Ma P，et al.Allogeneic bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for periodontal regeneration[J]. Journal of Dental Research，2014，93(2)：183-188.
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[7]李晓光，郭小龙，郭斌.BMAL1基因对骨髓间充质干细胞成骨分化的调控作用[J].华西口腔医学杂志，2016，34(3)：312-316.
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[8]刘亚丽，刘文佳，胡成虎，等.牙周慢性炎症对牙周膜干细胞生物学特性的影响[J].牙体牙髓牙周病学杂志，2014，24(1)：21-25.
[9]刘娟，孟波，赵华，等.人牙周膜细胞不同分离培养方法的比较研究[J].广东牙病防治，2011，19(12)：631-634.
[10]Greve B，Kelsch R，Spaniol K，et al.Flow cytometry in cancer stem cell analysis and separation[J].Cytometry Part A the Journal of the International Society for Analytical Cytology，2012，81A(4)：284-293.编辑/杨倩, http://www.100md.com(任娅岚 张湘宜 陈思思 白玲 刘春竹 刘亚丽)
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