CD164对胶质瘤细胞生长的影响研究(2)
1.2 mRNA的提取及检测
mRNA的提取实验步骤严格按照miRNA提取试剂盒操作步骤进行。CD164上游引物序列为：5′- GCTTCGCCAATTTGGGGTTG -3′，下游引物序列为5′-TATCCATCATTGTCGAATGTGT-3′，内参U6上游引物序列为：5′- CCTCTTAGATCACTATGGCAG-3′，下游引物序列为5′- GTTATTGAGCCATGGTTCGG-3′。依照PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒根据制造商的指示，cDNA经反转录生成。对mRNA进行定量分析检测步骤如下：95 °C温度下2 min，然后在95 °C温度下反应45 s和60 °C温度下反应60 s，持续30个循环，每个样本检测3次，通过2-△△Ct的方法计算CD164 mRNA的相对表达差异倍数，实验重复3次。
1.3试剂
Opti-MEM培养基、DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司； Trizol试剂和Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；shRNA NC和CD164 shRNA购自中国GenePharma；miRNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、RT-PCR 试剂盒和细胞蛋白提取试剂盒购自日本TaKaRa株式会社；CCK-8试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；PTEN和β-actin抗体购自美国Epitomics公司。
, http://www.100md.com
1.4细胞培养
人胚肾细胞株HEK-293T、胶质瘤细胞株SF295、SHG-44、U251和U251及人正常胶质细胞NHA细胞均由上海细胞生物研究所提供。细胞培养于DMEM培养基中，培养基中补充10%胎牛血清、青霉素(100 U/μl)和链霉素(100 μg/ml)。细胞在37 ℃且CO2 含量约为5%的细胞培养箱内进行培养。当细胞生长至占培养瓶底面积90%以上时用胰蛋白酶消化并用于实验。
1.5 构建慢病毒载体感染U251细胞及筛选
依照文献提供的CD164 shRNA有效靶序列设计并构建3条干扰序列及阴性对照序列，并筛选出一条最有效的干扰序列[7]，根据Lipofectamine2000制造商的指示将最优干扰序列的慢病毒表达载体经Lipofectamine2000转染至HEK-293T细胞中，收集病毒上清液离心并测定病毒滴度后感染SW480细胞，将病毒液感染细胞12 h后更换含10%胎牛血清的培养基，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白荧光，流式细胞仪检测感染效率。
, 百拇医药
1.6 将CD164 shRNA及shRNA NC感染至U251细胞
将对数生长期的U251细胞接种于24孔板中，每孔2×105个细胞，将5 μl浓度为20 μmol/L的CD164 shRNA与5 μl感染试剂lipofeetamine 2000混匀后加入细胞中，CD164 shRNA的感染终浓度为100 nmol/L，将培养板置于细胞培养箱中孵育48 h后进行相关功能性和western blot等检测。shRNA NC的感染方法同CD164 shRNA的感染。
1.7 CCK-8法检测细胞增殖
将U251细胞以每孔5×103个播种至96孔板中。在每个培养孔中添加完全培养基至100 μl在37 ℃含5%CO2细胞培养箱中至细胞融合，每孔添加CCK-8溶液(0.01 ml每孔)反应1 h，用酶标仪测定490 nm波长处吸光度值(A490)，实验重复5次，取平均值。
, http://www.100md.com
1.8 Western blot检测细胞中蛋白的表达
U251细胞在冰冷的PBS液中洗涤三次后重悬于细胞裂解液(100 μL/孔)中。当细胞裂片至于冰上反应30 min，再在4 °C温度下12000 g离心20 min，收集上清后使用BCA蛋白检测试剂盒对蛋白质浓度进行定量分析。蛋白质样品(30μg)使用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳进行后转移到0.45 μm的硝酸纤维素膜上，并使用5%脱脂奶粉于4 ℃下孵育过夜，该膜在4 °C与一抗在室温下反应30 min后，在室温下与二抗再次孵育1 h。以内参β-actin蛋白条带灰度值的比值来校正母的蛋白的光密度值。
1.9统计学处理
采用SPSS 17.0统计软件包进行统计学分析，数据均以(x±s)来表现，使用t检验和方差分析对所得样本数据进行统计学分析，统计学意义校正值设定为P<0.05。
, 百拇医药
2结果
2.1 CD164在胶质瘤组织中的表达
根据2007年WHO胶质瘤分类标准将纳入本组队列的45例病例进行分类，这45例胶质瘤患者临床病理学信息见表1。qRP-PCR检测结果表明，与正常脑组织正常组织相比较，CD164在胶质瘤组织中的表达显著上调(3.15±0.63 vs. 0.53±0.12)，有统计学显著性(P<0.001)。
2.2 CD164对体外胶质瘤细胞增殖的影响
western blot實验检测结果表明，CD164在人正常胶质细胞NHA中的表达量较低，而在人胶质瘤细胞株SF295、SHG-44、U87和U251中表达明显升高，差异有统计学意义(F=56.84， P<0.001)；同时与SF295、SHG-44和U87细胞相比较，U251细胞中CD164表达量明显升高(P<0.001)，后续试验选择U251细胞作为实验对象，见图1。
分别将CD164 shRNA或shRNA NC感染进入U251细胞72 h后，利用western blot检测U251细胞中的感染情况，结果表明细胞感染CD164 shRNA可显著下调CD164在U251细胞中的表达，差异有统计学意义(P<0.001)，而感染shRNA NC对CD164的相对表达量无明显影响(图1B)。而U251细胞感染CD164 shRNA后经CCK-8法检测细胞A490值为0.455±0.073，较阴性对照组(0.742±0.084)明显降低，差异有统计学显著性(t=8.563， P=0.013)。, http://www.100md.com(李志峰 陈勇 童仲驰)
mRNA的提取实验步骤严格按照miRNA提取试剂盒操作步骤进行。CD164上游引物序列为：5′- GCTTCGCCAATTTGGGGTTG -3′，下游引物序列为5′-TATCCATCATTGTCGAATGTGT-3′，内参U6上游引物序列为：5′- CCTCTTAGATCACTATGGCAG-3′，下游引物序列为5′- GTTATTGAGCCATGGTTCGG-3′。依照PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒根据制造商的指示，cDNA经反转录生成。对mRNA进行定量分析检测步骤如下：95 °C温度下2 min，然后在95 °C温度下反应45 s和60 °C温度下反应60 s，持续30个循环，每个样本检测3次，通过2-△△Ct的方法计算CD164 mRNA的相对表达差异倍数，实验重复3次。
1.3试剂
Opti-MEM培养基、DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司； Trizol试剂和Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；shRNA NC和CD164 shRNA购自中国GenePharma；miRNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、RT-PCR 试剂盒和细胞蛋白提取试剂盒购自日本TaKaRa株式会社；CCK-8试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；PTEN和β-actin抗体购自美国Epitomics公司。
, http://www.100md.com
1.4细胞培养
人胚肾细胞株HEK-293T、胶质瘤细胞株SF295、SHG-44、U251和U251及人正常胶质细胞NHA细胞均由上海细胞生物研究所提供。细胞培养于DMEM培养基中，培养基中补充10%胎牛血清、青霉素(100 U/μl)和链霉素(100 μg/ml)。细胞在37 ℃且CO2 含量约为5%的细胞培养箱内进行培养。当细胞生长至占培养瓶底面积90%以上时用胰蛋白酶消化并用于实验。
1.5 构建慢病毒载体感染U251细胞及筛选
依照文献提供的CD164 shRNA有效靶序列设计并构建3条干扰序列及阴性对照序列，并筛选出一条最有效的干扰序列[7]，根据Lipofectamine2000制造商的指示将最优干扰序列的慢病毒表达载体经Lipofectamine2000转染至HEK-293T细胞中，收集病毒上清液离心并测定病毒滴度后感染SW480细胞，将病毒液感染细胞12 h后更换含10%胎牛血清的培养基，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白荧光，流式细胞仪检测感染效率。
, 百拇医药
1.6 将CD164 shRNA及shRNA NC感染至U251细胞
将对数生长期的U251细胞接种于24孔板中，每孔2×105个细胞，将5 μl浓度为20 μmol/L的CD164 shRNA与5 μl感染试剂lipofeetamine 2000混匀后加入细胞中，CD164 shRNA的感染终浓度为100 nmol/L，将培养板置于细胞培养箱中孵育48 h后进行相关功能性和western blot等检测。shRNA NC的感染方法同CD164 shRNA的感染。
1.7 CCK-8法检测细胞增殖
将U251细胞以每孔5×103个播种至96孔板中。在每个培养孔中添加完全培养基至100 μl在37 ℃含5%CO2细胞培养箱中至细胞融合，每孔添加CCK-8溶液(0.01 ml每孔)反应1 h，用酶标仪测定490 nm波长处吸光度值(A490)，实验重复5次，取平均值。
, http://www.100md.com
1.8 Western blot检测细胞中蛋白的表达
U251细胞在冰冷的PBS液中洗涤三次后重悬于细胞裂解液(100 μL/孔)中。当细胞裂片至于冰上反应30 min，再在4 °C温度下12000 g离心20 min，收集上清后使用BCA蛋白检测试剂盒对蛋白质浓度进行定量分析。蛋白质样品(30μg)使用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳进行后转移到0.45 μm的硝酸纤维素膜上，并使用5%脱脂奶粉于4 ℃下孵育过夜，该膜在4 °C与一抗在室温下反应30 min后，在室温下与二抗再次孵育1 h。以内参β-actin蛋白条带灰度值的比值来校正母的蛋白的光密度值。
1.9统计学处理
采用SPSS 17.0统计软件包进行统计学分析，数据均以(x±s)来表现，使用t检验和方差分析对所得样本数据进行统计学分析，统计学意义校正值设定为P<0.05。
, 百拇医药
2结果
2.1 CD164在胶质瘤组织中的表达
根据2007年WHO胶质瘤分类标准将纳入本组队列的45例病例进行分类，这45例胶质瘤患者临床病理学信息见表1。qRP-PCR检测结果表明，与正常脑组织正常组织相比较，CD164在胶质瘤组织中的表达显著上调(3.15±0.63 vs. 0.53±0.12)，有统计学显著性(P<0.001)。
2.2 CD164对体外胶质瘤细胞增殖的影响
western blot實验检测结果表明，CD164在人正常胶质细胞NHA中的表达量较低，而在人胶质瘤细胞株SF295、SHG-44、U87和U251中表达明显升高，差异有统计学意义(F=56.84， P<0.001)；同时与SF295、SHG-44和U87细胞相比较，U251细胞中CD164表达量明显升高(P<0.001)，后续试验选择U251细胞作为实验对象，见图1。
分别将CD164 shRNA或shRNA NC感染进入U251细胞72 h后，利用western blot检测U251细胞中的感染情况，结果表明细胞感染CD164 shRNA可显著下调CD164在U251细胞中的表达，差异有统计学意义(P<0.001)，而感染shRNA NC对CD164的相对表达量无明显影响(图1B)。而U251细胞感染CD164 shRNA后经CCK-8法检测细胞A490值为0.455±0.073，较阴性对照组(0.742±0.084)明显降低，差异有统计学显著性(t=8.563， P=0.013)。, http://www.100md.com(李志峰 陈勇 童仲驰)