我国弓形虫病研究进展(2)
2.3免疫细胞在弓形虫感染中的作用 弓形虫感染机体后，机体的免疫状态显著影响其结局，尤其细胞免疫与疾病的转归密切相关。参与细胞免疫的免疫细胞主要有巨噬细胞、自然杀伤细胞、T淋巴细胞等。
2.3.1单核巨噬细胞 研究表明，切断召集炎性单核细胞的信号，将导致弓形虫大量增殖[10]。激活的巨噬细胞可产生活性氧和活性氮中介物，并能杀伤弓形虫速殖子。IFN-γ可激活巨噬细胞达到消灭弓形虫的作用。新发现的鸟苷三磷酸酶P47家族，可调节宿主体内IFN-γ，抵抗弓形虫感染。当其积聚在弓形虫纳虫空泡中后，纳虫空泡膜破裂，弓形虫破出，可被消灭。巨噬细胞表面具有多种模式识别受体，可与弓形虫表面配体结合，激活巨噬细胞，也可与相应的细胞因子受体结合，进而激活巨噬细胞抵抗弓形虫的感染。
2.3.2 NK细胞 在弓形虫感染早期，NK细胞能够非特异杀伤被感染的细胞。巨噬细胞和DCs分泌的IL-18可以增强NK细胞对靶细胞的杀伤作用，当IL-18和IL-15联合作用时，可促使NK细胞增殖[13]。NK细胞可移行至感染部位，分泌IFN-γ，激活巨噬细胞，并促使巨噬细胞表达MHC-II类分子[14]。进一步促进巨噬细胞的吞噬功能及提高抗原提呈功能。
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2.3.3 T淋巴细胞 按其CD分子表型和功能的不同，T细胞分为CD4+T细胞和CD8+T细胞，两者对于宿主抵抗弓形虫感染较为重要。CD4+T细胞根据活化后分泌细胞因子的不同分为Th1和Th2细胞。正常情况下，机体的Th1/Th2细胞处于动态平衡。实验感染弓形虫的BALB/c小鼠，在急性期以Th1细胞应答为主，诱导炎症反应的发生以控制和清除弓形虫的感染；急性期后以Th2细胞应答为主， Th2细胞对Th1细胞应答的抑制减轻了Th1应答介导的免疫病理损伤，有助于小鼠度过急性感染期[15]。CD4+T细胞被活化后，还通过分泌IL-2，促使CD8+T细胞活化与增殖。CD8+T细胞被活化后，通过分泌IFN-γ及对弓形虫感染细胞的胞溶作用清除弓形虫[10]。
核苷酸结合寡聚化结构域蛋白是新发现的细胞质型模式识别受体，主要识别细胞质中的虫体成分，其中Nod2较为重要。小鼠缺损Nod2后，清除体内弓形虫的能力降低，IFN-γ产生水平降低[9]。
调节性T细胞，以发挥免疫抑制作用为主。研究发现，在弓形虫感染过程中，机体会产生短暂的免疫抑制。赵俊桃等[16]用弓形虫成囊株感染小鼠，观察T细胞亚群在感染后不同时期的变化，结果显示，调节性T细胞的高峰期是急性感染后Th1的短暂免疫下调期。提示感染弓形虫后机体没有发生过强免疫应答、没有出现严重病理损伤的原因可能是调节性T细胞参与了免疫抑制。此时，抗感染免疫与弓形虫感染处于平衡状态，小鼠进入弓形虫慢性感染状态。
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目前对于弓形虫侵入宿主细胞过程的研究，以及弓形虫致病机理的研究尚未明确。有些是在动物体内研究，在人类弓形虫致病机制中是否有类似的作用，有待证实；各种免疫细胞及其分泌的细胞因子虽具有抗弓形虫的免疫反应，但宿主也不能彻底清除弓形虫的感染等许多机制有待进一步研究。
3 弓形虫病诊断
3.1病原学诊断
3.1.1涂片染色法[17] 取急性期患者的腹水、羊水、脑脊液、骨髓或血液等，离心后取沉淀物作涂片，或采用活组织穿刺物涂片，经吉姆萨染色，镜检弓形虫滋养体。该法简便，但阳性率不高。随后在此基础上建立的免疫酶染色试验(IEST)，是以玻片上的甲醛固定的弓形虫作为抗原，与血清样本中抗体反应，加入酶标二抗及底物，以虫体周围出现完整的淡黄色作为阳性标准。该法简单、敏感、特异、快速，可在现场使用[18]。使用弓形虫抗血清的过氧化物免疫酶标记法能够检测到AIDS患者中枢神经系统中存在的弓形虫，对临近炎症灶的组织包囊检查可进行急性感染和潜伏感染的诊断[19]。
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3.1.2动物接种分离法或细胞培养法 将待检样本接种于小鼠腹腔，1周后剖杀，取其腹腔液镜检滋养体，待检样本也可接种于离体培养的单层有核细胞[17]。该方法难以与自然感染区分，自然界中存在的弱毒株感染可导致假阴性。
3.2免疫学诊断
3.2.1弓形虫染色试验 为经典的血清学方法，具有良好的特异性、敏感性和重复性。感染后数天即可出现抗体，可用于早期诊断[20]。但由于需用活虫做实验，临床实际很难获得，故此方法应用很少。
3.2.2间接血凝试验(IHA) 感染弓形虫后一个月左右IHA出现阳性，血清抗体效价可判断其感染状态。1：64为既往感染，1：256为近期感染，1：1024为现症患者。该法操作简便，敏感性高[20]。
3.2.3间接荧光抗体试验(IFAT) IFAT法既可检测血清中的抗体，也可检测组织内的虫体。具有较高的敏感性、特异性和重复性。但若有类风湿因子、抗核抗体可出现假阳性，结果判定易带有主观性。
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3.2.4酶联免疫吸附试验(ELISA) ELISA是当前诊断弓形虫感染应用最广的技术。可检测弓形虫抗体及Cag抗原。近年来，应用重组抗原作为诊断抗原诊断弓形虫病，具有较高的敏感性[19]。ELISA又衍生出多种改进的方法，如斑点酶联-免疫吸附試验(Dot-ELISA)、桥联法(ABC-ELISA)、PCR-ELISA法、SPA-ELISA等，具有较高的敏感性与特异性。
3.3核酸检测
3.3.1核酸探针技术 本方法可直接检测出寄生虫基因，与病原学诊断效果相当。也用于寄生虫虫种鉴定、种群分类等方面。
3.3.2 PCR及其衍生技术 已广泛应用于弓形虫病诊断。包括普通PCR技术、PCR-RFLP技术、原位PCR、套式PCR等多种技术与方法。具有快速、灵敏、特异、操作简便等优点。
弓形虫病检测方法有很多，病原学检测仍是确诊弓形虫病最可靠的方法，但其检出率低。血清学诊断可用于现场检测，可检测血清中抗体及循环抗原，有些方法可检测动物的潜伏感染、现症感染乃至先天感染，但是，血清学诊断不适用于免疫抑制患者，有些易出现假阳性，有些方法还不太成熟。现代PCR方法，可检测病原体的核酸，准确可靠，对免疫系统低下或丧失的患者是一个很好的诊断方法，弥补了血清学诊断的不足，但价格昂贵。因此，寻找快速、准确、经济的诊断试剂盒已迫在眉睫。, 百拇医药(韩梅 吴寒)
2.3.1单核巨噬细胞 研究表明，切断召集炎性单核细胞的信号，将导致弓形虫大量增殖[10]。激活的巨噬细胞可产生活性氧和活性氮中介物，并能杀伤弓形虫速殖子。IFN-γ可激活巨噬细胞达到消灭弓形虫的作用。新发现的鸟苷三磷酸酶P47家族，可调节宿主体内IFN-γ，抵抗弓形虫感染。当其积聚在弓形虫纳虫空泡中后，纳虫空泡膜破裂，弓形虫破出，可被消灭。巨噬细胞表面具有多种模式识别受体，可与弓形虫表面配体结合，激活巨噬细胞，也可与相应的细胞因子受体结合，进而激活巨噬细胞抵抗弓形虫的感染。
2.3.2 NK细胞 在弓形虫感染早期，NK细胞能够非特异杀伤被感染的细胞。巨噬细胞和DCs分泌的IL-18可以增强NK细胞对靶细胞的杀伤作用，当IL-18和IL-15联合作用时，可促使NK细胞增殖[13]。NK细胞可移行至感染部位，分泌IFN-γ，激活巨噬细胞，并促使巨噬细胞表达MHC-II类分子[14]。进一步促进巨噬细胞的吞噬功能及提高抗原提呈功能。
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2.3.3 T淋巴细胞 按其CD分子表型和功能的不同，T细胞分为CD4+T细胞和CD8+T细胞，两者对于宿主抵抗弓形虫感染较为重要。CD4+T细胞根据活化后分泌细胞因子的不同分为Th1和Th2细胞。正常情况下，机体的Th1/Th2细胞处于动态平衡。实验感染弓形虫的BALB/c小鼠，在急性期以Th1细胞应答为主，诱导炎症反应的发生以控制和清除弓形虫的感染；急性期后以Th2细胞应答为主， Th2细胞对Th1细胞应答的抑制减轻了Th1应答介导的免疫病理损伤，有助于小鼠度过急性感染期[15]。CD4+T细胞被活化后，还通过分泌IL-2，促使CD8+T细胞活化与增殖。CD8+T细胞被活化后，通过分泌IFN-γ及对弓形虫感染细胞的胞溶作用清除弓形虫[10]。
核苷酸结合寡聚化结构域蛋白是新发现的细胞质型模式识别受体，主要识别细胞质中的虫体成分，其中Nod2较为重要。小鼠缺损Nod2后，清除体内弓形虫的能力降低，IFN-γ产生水平降低[9]。
调节性T细胞，以发挥免疫抑制作用为主。研究发现，在弓形虫感染过程中，机体会产生短暂的免疫抑制。赵俊桃等[16]用弓形虫成囊株感染小鼠，观察T细胞亚群在感染后不同时期的变化，结果显示，调节性T细胞的高峰期是急性感染后Th1的短暂免疫下调期。提示感染弓形虫后机体没有发生过强免疫应答、没有出现严重病理损伤的原因可能是调节性T细胞参与了免疫抑制。此时，抗感染免疫与弓形虫感染处于平衡状态，小鼠进入弓形虫慢性感染状态。
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目前对于弓形虫侵入宿主细胞过程的研究，以及弓形虫致病机理的研究尚未明确。有些是在动物体内研究，在人类弓形虫致病机制中是否有类似的作用，有待证实；各种免疫细胞及其分泌的细胞因子虽具有抗弓形虫的免疫反应，但宿主也不能彻底清除弓形虫的感染等许多机制有待进一步研究。
3 弓形虫病诊断
3.1病原学诊断
3.1.1涂片染色法[17] 取急性期患者的腹水、羊水、脑脊液、骨髓或血液等，离心后取沉淀物作涂片，或采用活组织穿刺物涂片，经吉姆萨染色，镜检弓形虫滋养体。该法简便，但阳性率不高。随后在此基础上建立的免疫酶染色试验(IEST)，是以玻片上的甲醛固定的弓形虫作为抗原，与血清样本中抗体反应，加入酶标二抗及底物，以虫体周围出现完整的淡黄色作为阳性标准。该法简单、敏感、特异、快速，可在现场使用[18]。使用弓形虫抗血清的过氧化物免疫酶标记法能够检测到AIDS患者中枢神经系统中存在的弓形虫，对临近炎症灶的组织包囊检查可进行急性感染和潜伏感染的诊断[19]。
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3.1.2动物接种分离法或细胞培养法 将待检样本接种于小鼠腹腔，1周后剖杀，取其腹腔液镜检滋养体，待检样本也可接种于离体培养的单层有核细胞[17]。该方法难以与自然感染区分，自然界中存在的弱毒株感染可导致假阴性。
3.2免疫学诊断
3.2.1弓形虫染色试验 为经典的血清学方法，具有良好的特异性、敏感性和重复性。感染后数天即可出现抗体，可用于早期诊断[20]。但由于需用活虫做实验，临床实际很难获得，故此方法应用很少。
3.2.2间接血凝试验(IHA) 感染弓形虫后一个月左右IHA出现阳性，血清抗体效价可判断其感染状态。1：64为既往感染，1：256为近期感染，1：1024为现症患者。该法操作简便，敏感性高[20]。
3.2.3间接荧光抗体试验(IFAT) IFAT法既可检测血清中的抗体，也可检测组织内的虫体。具有较高的敏感性、特异性和重复性。但若有类风湿因子、抗核抗体可出现假阳性，结果判定易带有主观性。
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3.2.4酶联免疫吸附试验(ELISA) ELISA是当前诊断弓形虫感染应用最广的技术。可检测弓形虫抗体及Cag抗原。近年来，应用重组抗原作为诊断抗原诊断弓形虫病，具有较高的敏感性[19]。ELISA又衍生出多种改进的方法，如斑点酶联-免疫吸附試验(Dot-ELISA)、桥联法(ABC-ELISA)、PCR-ELISA法、SPA-ELISA等，具有较高的敏感性与特异性。
3.3核酸检测
3.3.1核酸探针技术 本方法可直接检测出寄生虫基因，与病原学诊断效果相当。也用于寄生虫虫种鉴定、种群分类等方面。
3.3.2 PCR及其衍生技术 已广泛应用于弓形虫病诊断。包括普通PCR技术、PCR-RFLP技术、原位PCR、套式PCR等多种技术与方法。具有快速、灵敏、特异、操作简便等优点。
弓形虫病检测方法有很多，病原学检测仍是确诊弓形虫病最可靠的方法，但其检出率低。血清学诊断可用于现场检测，可检测血清中抗体及循环抗原，有些方法可检测动物的潜伏感染、现症感染乃至先天感染，但是，血清学诊断不适用于免疫抑制患者，有些易出现假阳性，有些方法还不太成熟。现代PCR方法，可检测病原体的核酸，准确可靠，对免疫系统低下或丧失的患者是一个很好的诊断方法，弥补了血清学诊断的不足，但价格昂贵。因此，寻找快速、准确、经济的诊断试剂盒已迫在眉睫。, 百拇医药(韩梅 吴寒)