诺如病毒检测技术研究(1)
摘 要：诺如病毒是非细菌性腹泻暴发的主要病原之一，对相关检测技术的研究十分必要。本文通过引物、探针、染料的选择，结合适用范围、灵敏度、特异性、重复性的评估对常规反转录-聚合酶链反应、荧光定量RT-PCR、反转录-环介导等温扩增、基因芯片、酶联免疫吸附测定和荧光微球检测条快速检测诺如病毒的技术进行了综述。着重关注了食品和水中诺如病毒检测的病毒富集技术，并提出平衡准确灵敏与简便高效对诺如病毒检测技术的研究具有重要意义。
关键词：诺如病毒；聚合酶链反应；荧光定量；反转录；RT-PCR；RT-LAMP
中图分类号：R373.2+5 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.02.18
文章编号：1006-1959(2018)02-0051-03
Abstract：Norovirus is one of the main pathogens in non bacterial diarrhea，research on correlation detection technology is very necessary.This paper probes，primers，dye selection，combined with the applicable scope，sensitivity，specificity，repeatability of the evaluation of conventional reverse transcription polymerase chain reaction，fluorescence quantitative reverse transcription loop mediated RT-PCR.Mediated isothermal amplification，gene chip，ELISA and fluorescent microsphere detection strip for rapid detection of norovirus technology are reviewed.Focusing on the technology of virus detection in food and water enrichment of norovirus，and put forward the balance is accurate and sensitive and efficient research on the detection of norovirus has important significance.
, 百拇医药
Key words：Norovirus；Polymerase chain reaction；Fluorescence quantitation；Reverse transcription；RT-PCR；RT-LAMP
諾如病毒(norovirus)引起的急性肠胃炎在我国成上升趋势，尤其在学校、幼儿园、养老院等低抵抗力人群聚集地易引起集体暴发。诺如病毒传染性很强，可经粪-口传播、人传人、可经受病毒污染的水、食品等传播。据估计，由诺如病毒造成的非细菌性腹泻暴发占总数的50%～80%左右[1]。近年来，诺如病毒检测方法的相关研究快速发展，对诺如病毒的准确检测为其流行病学分析提供了依据，是有效防控该病毒的基础。
1 病毒分型
诺如病毒依据其基因RNA聚合酶和主要衣壳蛋白VP1的核苷酸序列的同源性，可分为5个基因组：GⅠ、GⅡ、GⅢ、GⅣ、GⅤ，其中易感染人的主要是GⅠ和GⅡ基因组，国内尤以 GⅡ为多。而基于VP1基因组序列的相似性以>85%为界，可进一步将基因组分为不同的基因型：GⅠ-8个型，GⅡ-21个型，GⅢ-3个型，GⅣ-2个型，GⅤ-1个型[2]。
, 百拇医药
2 检测技术的研究进展
目前诺如病毒的检测技术主要有反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、荧光定量RT-PCR、反转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)、基因芯片、酶联免疫吸附测定(ELISA)和荧光微球检测条快速检测。
2.1 常规反转录-聚合酶链反应 反转录RT技术是将RNA为模板，以反转录酶催化，用引物合成互补DNA，再经PCR采用特异性引物扩增[3]，是定性检测诺如病毒的经典技术。
王作虪等[4]用RT-PCR对131份腹泻儿童的粪便标准进行检测，使用两对引物：① JV12：5'ATACCACTATGATGCAGATTA 3'/SM31：5'CGATTTCATCATCACCATA 3'，扩增目标长度为432bp；②4581： 5'TCTTCTCCTTCTATGGTGATGATGA3'/5102：5'CTTAGACGCCATCTTCATTTACG 3'，扩增目标长度为522bp，通过振荡离心过滤后从粪便标本中提取出病毒RNA，经引物反转录后PCR扩增，1.5%琼脂糖凝胶检测特异性片段，结果131份粪便标本中检出诺如病毒阳性22份，阳性标本经和已知核苷酸序列比对鉴定出22份标准均为GⅡ4型。
, http://www.100md.com
2.2荧光定量RT-PCR 实时荧光定量RT-PCR技术是在RT-PCR技术的基础上利用染料或探针监测PCR反应管中的荧光信号从而达到定量的目的，目前实时荧光定量RT-PCR已逐渐替代常规RT-PCR成为应用最为广泛的定量定性检测诺如病毒的技术。
陈传德等[5]选择了两种不同型号的荧光定量PCR仪，分别制作绝对定量标准曲线，以OG 1F/COG 1R、COG 2F/COG 2R为引物，以Taqman探针监测荧光信号，建立了有良好灵敏度、重复性的荧光定量RT-PCR快速检测诺如病毒的技术，并通过试验了轮状病毒、腺病毒、星状病毒、肠道病毒等易引起干扰的病毒，得出该方法具有良好的特异性。刘巍等[6]比较了荧光定量RT-PCR、常规RT-PCR、酶联免疫法ELISA，对34个粪便样本阳性检出率分别为85.3%、76.5%、26.5%，可见荧光定量RT-PCR技术对诺如病毒的检测灵敏度较高。王毅谦等[7]用双重荧光RT-PCR的方法检测GⅠ和GⅡ型诺如病毒，该研究使用allglo探针，对GⅠ和GⅡ型诺如病毒的检出限为10copies/μl，比Taqman探针法和单重荧光RT-PCR法更加灵敏，该研究设计的引物和allglo探针，标记不同的荧光报告集团MAR和JUP，可于同一反应管内同时检测GⅠ和GⅡ型诺如病毒，提高了检测效率。莫雪梅等[8]用SYBR GreenⅠ荧光染料RT-PCR法检测了贝类中的GⅡ型诺如病毒，检测下限为100copies，检测的稳定性较好，研究证明SYBR GreenⅠ荧光染料的浓度是影响结果的关键因素，浓度过低造成荧光强度小灵敏度不够，浓度过高会抑制PCR反应，SYBR GreenⅠ荧光染料的终浓度为1×是合适的，此外该研究还将退火温度提高到52 ℃以消减引物二聚体引起的干扰，达到了良好的效果。, 百拇医药(潘卫兵 许韡)
关键词：诺如病毒；聚合酶链反应；荧光定量；反转录；RT-PCR；RT-LAMP
中图分类号：R373.2+5 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.02.18
文章编号：1006-1959(2018)02-0051-03
Abstract：Norovirus is one of the main pathogens in non bacterial diarrhea，research on correlation detection technology is very necessary.This paper probes，primers，dye selection，combined with the applicable scope，sensitivity，specificity，repeatability of the evaluation of conventional reverse transcription polymerase chain reaction，fluorescence quantitative reverse transcription loop mediated RT-PCR.Mediated isothermal amplification，gene chip，ELISA and fluorescent microsphere detection strip for rapid detection of norovirus technology are reviewed.Focusing on the technology of virus detection in food and water enrichment of norovirus，and put forward the balance is accurate and sensitive and efficient research on the detection of norovirus has important significance.
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Key words：Norovirus；Polymerase chain reaction；Fluorescence quantitation；Reverse transcription；RT-PCR；RT-LAMP
諾如病毒(norovirus)引起的急性肠胃炎在我国成上升趋势，尤其在学校、幼儿园、养老院等低抵抗力人群聚集地易引起集体暴发。诺如病毒传染性很强，可经粪-口传播、人传人、可经受病毒污染的水、食品等传播。据估计，由诺如病毒造成的非细菌性腹泻暴发占总数的50%～80%左右[1]。近年来，诺如病毒检测方法的相关研究快速发展，对诺如病毒的准确检测为其流行病学分析提供了依据，是有效防控该病毒的基础。
1 病毒分型
诺如病毒依据其基因RNA聚合酶和主要衣壳蛋白VP1的核苷酸序列的同源性，可分为5个基因组：GⅠ、GⅡ、GⅢ、GⅣ、GⅤ，其中易感染人的主要是GⅠ和GⅡ基因组，国内尤以 GⅡ为多。而基于VP1基因组序列的相似性以>85%为界，可进一步将基因组分为不同的基因型：GⅠ-8个型，GⅡ-21个型，GⅢ-3个型，GⅣ-2个型，GⅤ-1个型[2]。
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2 检测技术的研究进展
目前诺如病毒的检测技术主要有反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、荧光定量RT-PCR、反转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)、基因芯片、酶联免疫吸附测定(ELISA)和荧光微球检测条快速检测。
2.1 常规反转录-聚合酶链反应 反转录RT技术是将RNA为模板，以反转录酶催化，用引物合成互补DNA，再经PCR采用特异性引物扩增[3]，是定性检测诺如病毒的经典技术。
王作虪等[4]用RT-PCR对131份腹泻儿童的粪便标准进行检测，使用两对引物：① JV12：5'ATACCACTATGATGCAGATTA 3'/SM31：5'CGATTTCATCATCACCATA 3'，扩增目标长度为432bp；②4581： 5'TCTTCTCCTTCTATGGTGATGATGA3'/5102：5'CTTAGACGCCATCTTCATTTACG 3'，扩增目标长度为522bp，通过振荡离心过滤后从粪便标本中提取出病毒RNA，经引物反转录后PCR扩增，1.5%琼脂糖凝胶检测特异性片段，结果131份粪便标本中检出诺如病毒阳性22份，阳性标本经和已知核苷酸序列比对鉴定出22份标准均为GⅡ4型。
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2.2荧光定量RT-PCR 实时荧光定量RT-PCR技术是在RT-PCR技术的基础上利用染料或探针监测PCR反应管中的荧光信号从而达到定量的目的，目前实时荧光定量RT-PCR已逐渐替代常规RT-PCR成为应用最为广泛的定量定性检测诺如病毒的技术。
陈传德等[5]选择了两种不同型号的荧光定量PCR仪，分别制作绝对定量标准曲线，以OG 1F/COG 1R、COG 2F/COG 2R为引物，以Taqman探针监测荧光信号，建立了有良好灵敏度、重复性的荧光定量RT-PCR快速检测诺如病毒的技术，并通过试验了轮状病毒、腺病毒、星状病毒、肠道病毒等易引起干扰的病毒，得出该方法具有良好的特异性。刘巍等[6]比较了荧光定量RT-PCR、常规RT-PCR、酶联免疫法ELISA，对34个粪便样本阳性检出率分别为85.3%、76.5%、26.5%，可见荧光定量RT-PCR技术对诺如病毒的检测灵敏度较高。王毅谦等[7]用双重荧光RT-PCR的方法检测GⅠ和GⅡ型诺如病毒，该研究使用allglo探针，对GⅠ和GⅡ型诺如病毒的检出限为10copies/μl，比Taqman探针法和单重荧光RT-PCR法更加灵敏，该研究设计的引物和allglo探针，标记不同的荧光报告集团MAR和JUP，可于同一反应管内同时检测GⅠ和GⅡ型诺如病毒，提高了检测效率。莫雪梅等[8]用SYBR GreenⅠ荧光染料RT-PCR法检测了贝类中的GⅡ型诺如病毒，检测下限为100copies，检测的稳定性较好，研究证明SYBR GreenⅠ荧光染料的浓度是影响结果的关键因素，浓度过低造成荧光强度小灵敏度不够，浓度过高会抑制PCR反应，SYBR GreenⅠ荧光染料的终浓度为1×是合适的，此外该研究还将退火温度提高到52 ℃以消减引物二聚体引起的干扰，达到了良好的效果。, 百拇医药(潘卫兵 许韡)